针对上述问题，华南理工大学曹晓东教授团队提出了一种新的概念设计，通过在聚多巴胺（PDA）和聚-L-赖氨酸（PLL）修饰的镁掺杂生物活性玻璃（MgBG）界面上，对来自骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞外小囊泡（sEVs）进行自组装编程，成功构建了一种新型的sEVs@PPMB（EPPM）囊泡簇，该囊泡簇在增强内吞作用方面具有非凡的效率。通过将温和的席夫碱反应与氧化葡聚糖（OD）和季铵化壳聚糖（QCS）相结合，开发了一种多功能水凝胶（EPPMO），可以快速促进糖尿病伤口愈合。该文章于2025年4月3日以《A multifunctional hydrogel loaded with magnesium-doped bioactive glass-induced vesicle clusters enhances diabetic wound healing by promoting intracellular delivery of extracellular vesicles》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.03.025）。

图1. EPPMO水凝胶制备工艺示意图

（1）PPMO水凝胶的表征

如图2a所示，利用聚多巴胺（PDA）和聚-L-赖氨酸（PLL）修饰MgBG来合成PPMB，再由PPMB和QCS与OD通过席夫碱反应制备得到了PPMO水凝胶。Zeta电位分析（图2b）表明PP0.5-MB电位为4.75 ± 4.11 mV。 PPMO水凝胶的制备过程如图2c所示，PPMB和QCS侧链上的氨基与OD侧链上的醛基通过席夫碱反应结合，凝胶化时间约为120秒，席夫碱键的动态可逆性赋予了PPMO水凝胶良好的可注射性、自愈合性和组织粘附性。PPMO水凝胶的可注射性如图2d所示，它可以通过1毫升注射器均匀挤出，形成完整的星形或圆形。PPMO水凝胶的自愈合特性如图2e所示，当两块红色和蓝色的PPMO水凝胶接触并融合时，它们会形成一个没有明显边界的单一实体。PPMO水凝胶的组织界面粘附特性如图2f所示，水凝胶可以粘附在猪皮表面，在旋转或折叠后仍能保持其形状。具有光热效应的水凝胶敷料在近红外（NIR）光激发下可以产生局部高温，有效破坏细菌生物膜，PDA修饰的PPMB的加入使这些水凝胶具有将光能转化为热能的能力。使用808 nm NIR在不同功率水平下测试了5% PPMO水凝胶的光热效应，如图2g和h所示。经过10分钟的照射后，随着NIR强度从0.5 W/cm²逐渐增加到2 W/cm²，5% PPMO水凝胶的最大光热温度从39.7 ℃上升到64.3 ℃。随后，评估了在1 W/cm²的NIR强度下不同PPMB含量的水凝胶的光热性能，如图2i和j所示。与OQ水凝胶相比，PPMO水凝胶的最大光热温度随着PPMB含量的增加而呈梯度增加，显示出浓度依赖性关系。然而，超过50 ℃的温度可能会导致sEVs中的miRNA和其他活性成分降解。因此，后续实验采用1 W/cm²的NIR强度、6分钟的照射时间和45 ℃的目标温度。

图2. PPMO水凝胶的表征。（a）水凝胶制备示意图。（b）纳米粒子的Zeta电位分析结果。（c）水凝胶的制备工艺。（d）水凝胶的可注射性。（e）水凝胶的自愈合性能。（f）水凝胶的皮肤粘附性能。（g）5% PPMO水凝胶在不同近红外强度下的温度变化曲线。（h）5% PPMO在不同近红外强度下的温度变化图像。（i）近红外强度为1 W/cm²时水凝胶的温度变化曲线。（j）近红外强度为1 W/cm2时水凝胶的温度变化图像

（2）EPPMO水凝胶的表征

如图3a所示。首先，从骨髓间充质干细胞（BMSCs）中提取sEVs，通过sEVs与PPMB的蛋白吸附和静电相互作用成功制备EPPM囊泡簇，TEM和粒径分析显示sEVs呈球形或盘状，平均直径为63.1 ± 4.12 nm（图3b和c）。通过将sEVs与PPMB共孵育来制备EPPM囊泡簇，结果如图3d所示，sEVs用绿色细胞膜绿色荧光标记染色，与未修饰的MgBG相比，PDA-MgBG、PP0.2-MB和PP0.5-MB的sEVs荧光强度显著更高。如图3e所示，未处理的MgBG的sEVs负载率为4.4 ± 0.40%，而仅用PDA修饰的PDA-MgBG显示出一定的负载能力，PP0.5-MB（用PDA和PLL修饰）的sEVs负载率为66.5 ± 0.46%，显著高于其他纳米颗粒。为了验证sEVs与PP0.5-MB之间的结合模式，进行了zeta电位分析（图3f），表明通过PDA介导的蛋白吸附和静电相互作用实现了sEVs的负载。通过Western blot分析（图3g），与sEVs相比，负载在EPPM上的sEVs以及经过EPPMO NIR（+）处理的sEVs的CD9、CD63和TSG101相对蛋白水平下降了，处理之间没有显著差异，这些结果表明，经过一系列处理后制备的EPPMO中的sEVs保持了良好的生物功能。如图3h所示，当sEVs直接负载在OQ水凝胶上时，EO水凝胶在pH = 6.5时3天内快速释放，释放率约为70.8%。相比之下，EPPMO水凝胶在pH = 6.5时3天内仅释放了47.5%的sEVs。糖尿病伤口（DWs）的治疗周期通常较长。EPPMO水凝胶的长期持续释放sEVs可以有效延长sEVs在伤口部位的作用时间，从而促进伤口愈合。

图3.EPPMO水凝胶的表征。（a）EPPM制备示意图。（b）sEVs的透射电镜图像。（c）sEVs的纳米颗粒粒径分布。（d）复合纳米颗粒的荧光图像：sEVs（绿色）和PPMB（灰色）。（e）sEVs的装载效率。（f）Zeta电位分析。（g）Western blot结果。（h）在pH 7.4和6.5条件下，水凝胶中sEVs的累积释放结果

通过Transwell共培养系统评估了EPPMO水凝胶的细胞活性（图4a）。细胞接种在孔板底部，将50 μL水凝胶放置在Transwell上层室中进行后续细胞实验。通过3D成像（图4b）证实sEVs（红色）、PPMB（绿色）和EPPM在水凝胶中均匀分布，表明实现了纳米颗粒的成功负载。持续性炎症是糖尿病伤口愈合的主要挑战之一，因此免疫调节和抗炎作用对于糖尿病伤口修复至关重要。RAW 264.7细胞对囊泡簇的内化作用分析（图4c）表明，在12 h时，未修饰的MgBG组未观察到明显的绿色荧光，而PPMB被细胞内化但荧光强度较低。与自由释放的sEVs相比，EPPM的细胞内化增加了约8.2倍（图4d）。在糖尿病伤口的增殖阶段，血管化对于营养运输和伤口愈合至关重要。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）是血管生成的关键参与者，研究了其对囊泡簇的内化作用（图4e）。HUVECs对纳米颗粒摄取的荧光成像与RAW 264.7细胞的结果相似，EPPM显示出显著更高的细胞内化效率，比单独的sEVs高约16.7倍（图4f）。将囊泡簇加载到EPPMO水凝胶中保留了sEVs的活性，增强了生物利用度，并促进了MgBG的细胞内递送和积累，有效调节了细胞的生物学功能。

图4. EPPM囊泡簇的细胞内化检测。（a）细胞与EPPMO水凝胶共培养的示意图。（b）水凝胶内纳米颗粒的分布情况。（c）水凝胶释放的纳米颗粒被RAW 264.7细胞摄取图像和（d）定量荧光面积结果。（e）水凝胶释放的纳米颗粒被HUVECs摄取图像和（f）定量荧光面积结果

（3）水凝胶的抗菌性能

在细菌感染会引发慢性炎症，进一步阻碍伤口愈合。图5a展示了水凝胶对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌效果。在未使用近红外光（NIR）处理的情况下，所有OQ水凝胶对大肠杆菌的抗菌率均超过90%。在使用NIR处理的情况下，PPMO和EPPMO水凝胶的光热特性实现了约99.9%的抗菌率，琼脂平板上的菌落计数结果（图5b）与基于吸光度的抗菌结果一致。此外，图5c展示了水凝胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌效果，所有水凝胶在NIR处理和未处理的情况下，对金黄色葡萄球菌的抗菌率均超过95%，琼脂平板结果（图5d）也证实了这一点。这些结果表明，EPPMO水凝胶系统的光热效应可以有效杀死细菌，增强抗菌剂的疗效，从而促进糖尿病伤口愈合。

图5.在808纳米近红外（1 W/cm²）下的光热抗菌效果水凝胶的抗菌性能。（a）水凝胶对大肠杆菌的抗菌率。（b）大肠杆菌菌落存活情况。（c）水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌率。（d）金黄色葡萄球菌菌落存活情况。NIR（−）表示未进行近红外处理，NIR（+）表示进行了近红外处理

（4）水凝胶的生物相容性和细胞招募能力

为了评估水凝胶对L929成纤维细胞（L929）和HUVECs的细胞活性，采用CCK8实验进行检测。结果表明，含有sEVs的EO和EPPMO水凝胶不仅展现出良好的生物相容性，还能显著促进细胞增殖（图6a-d）。这种促进作用归因于sEVs携带的多种促进细胞增殖的营养物质。为了评估水凝胶的细胞招募能力，进行了12小时的Transwell实验及其定量分析（图6e-f），结果显示，对照组和OQ水凝胶组没有细胞招募能力。然而，添加了sEVs和MgBG的EO、PPMO和EPPMO水凝胶显著增强了L929的招募能力，其中EPPMO水凝胶表现最为显著。此外，通过划痕实验评估了水凝胶促进L929迁移的能力（图6g），24小时后，对照组的迁移率为46.1 ± 10.96%，而EPPMO水凝胶组的迁移率达到了92.7 ± 4.07%，在EPPMO水凝胶组中，划痕区域完全消失，表明其显著促进了L929的迁移（图6h）。

图6.水凝胶的生物相容性和细胞招募性能。（a） L929细胞经水凝胶处理后的活/死细胞染色结果。（b）经水凝胶处理的L929细胞CCK8检测结果。（c）通过水凝胶对人脐静脉内皮细胞进行活/死细胞染色。（d）水凝胶处理后HUVECs的CCK-8检测结果。（e-f）Transwell实验及其半定量分析L929细胞与水凝胶的实验结果。（g-h）划痕试验及其半定量分析结果

（5）巨噬细胞的M2表型极化

为了评估水凝胶对巨噬细胞极化的影响，使用RT-qPCR检测了RAW 264.7巨噬细胞中炎症相关基因的表达（图7a），与未处理的对照组相比，LPS处理的M0巨噬细胞极化为促炎的M1型，表现为促炎因子TNF-α和iNOS表达升高，而抗炎因子Arg-1和IL-10表达降低。与LPS处理相比，EO、PPMO和EPPMO水凝胶组显著降低了促炎因子TNF-α和iNOS的表达，同时显著增加了抗炎因子Arg-1和IL-10的表达。此外，通过免疫荧光染色检测了M1型巨噬细胞标记物iNOS和M2型巨噬细胞标记物IL-10的表达，结果由图7b-e所示，与对照组、LPS组和OQ组相比，EPPMO水凝胶组的iNOS表达显著降低，而IL-10表达显著增加。此外，还对NF-κB信号通路中的p65蛋白进行了免疫荧光染色（图7f），在未激活的NF-κB信号通路中，p65蛋白（红色）保留在细胞质中，核转位受到抑制（对照组），经LPS处理的巨噬细胞显示出NF-κB信号通路的激活，极化为M1型巨噬细胞，p65转移到细胞核（LPS组和OQ组）。与这些组相比，EPPMO水凝胶组显示出最显著的p65核转位抑制，这是因为EPPMO水凝胶释放的EPPM被细胞有效内化，EPPM携带的miR-199a、miR-146等免疫调节miRNA与MgBG释放的Mg²⁺协同作用，有效抑制了NF-κB信号通路的激活，从而防止了p65的核转位，并促进了M1到M2型巨噬细胞的极化，实现了联合抗炎效果。

图7.水凝胶调节巨噬细胞极化的能力。（a）通过RT-qPCR检测巨噬细胞中的抗炎基因Arg-1和IL-10以及促炎基因TNF-α和iNOS的表达。（b-c）iNOS蛋白表达的免疫荧光染色及半定量分析。（d-e）免疫荧光IL-10蛋白表达的染色及半定量分析。（f） p65蛋白的免疫荧光染色

（6）水凝胶的促血管生成能力

在糖尿病伤口（DWs）的增殖阶段，血管化对于营养运输和伤口愈合至关重要。通过RT-qPCR检测了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中血管生成相关基因的表达（图8a-d），结果显示，EPPMO水凝胶组显著上调了HIF-α和VEGF基因的表达，同时VEGF受体KDR的表达也显著增加，促进血管生成的eNOS基因在EPPMO水凝胶组中也表现出显著上调。为了进一步评估水凝胶对HUVECs血管生成性能的影响，采用免疫荧光检测了血管生成标记蛋白CD31的表达（图8e-f），结果显示，EO、PPMO和EPPMO水凝胶组均能促进CD31的表达，其中EPPMO水凝胶组的增加最为显著。此外，还进行了基质胶形成的管状结构实验，结果如图8g所示，呈现出与免疫荧光染色相似的趋势。这些结果表明，EPPMO水凝胶通过促进血管生成相关基因的表达，增强了血管生成能力，从而在糖尿病伤口愈合过程中发挥了重要作用。

图8.水凝胶血管生成性能的评价。（a-d）通过rt-qpcr检测的huvec中血管生成相关基因hif-α，VEGF，KDR和eNOS的表达。（e-f）免疫荧光法测定CD31 蛋白的表达及其半定量分析结果。（g）基质胶基质形成血管的钙黄素AM染色

（7）动物实验

使用SD大鼠的糖尿病感染性全层皮肤缺损模型（图9a）来评估水凝胶在体内促进伤口愈合的能力。在术后3天，空白组（Blank）的伤口尚未结痂且有化脓现象（图9b），而OQ和EO水凝胶组的伤口没有显著的化脓。此外，由于纳米簇的温和光热效应和QCS的抗菌特性，PPMO和EPPMO组的伤口迅速结痂，没有明显的感染和溃疡迹象。值得注意的是，EPPMO组的伤口开始显示出愈合的初步迹象。在术后14天，EPPMO组的伤口几乎完全愈合，其他水凝胶组的伤口愈合情况良好，而空白组的伤口仍未完全结痂。对组织形态进行半定量分析（图9c和d）显示，EPPMO水凝胶组的伤口愈合率显著高于其他组。

图9.水凝胶系统结合近红外辐射对促进糖尿病皮肤缺损愈合效果的评价。（a）糖尿病皮肤伤口模型的构建过程示意图。（b）用不同水凝胶样品处理的皮肤伤口区域的宏观图像。（c）术后第3天、第7天及第14天的皮肤伤口闭合情况。（d）术后第3、7和14天的伤口闭合率定量数据

为了进一步研究SD大鼠的炎症微环境和血管生成，对伤口组织进行了免疫组化染色，检测抗炎标志物IL-10（绿色，图10a,d）和促炎标志物TNF-α（红色，图10a,e），在第3天，空白组和OQ组显示出显著的TNF-α阳性表达，而IL-10表达为阴性。然而，在加入抗炎剂后，EO和PPMO组显示出促炎因子的显著减少和抗炎因子IL-10的阳性表达，在sEVs和PPMB的协同作用下，EPPMO组显示出促炎因子的显著减少和IL-10的阳性表达，表明其具有卓越的抗炎能力。使用免疫组化染色检测α-SMA（绿色）和CD31（红色）来评估DWs中的血管生成（图10b,f），空白组和OQ组CD31表达较低，而含有sEVs的PPMO组增加了相关蛋白的表达，得益于sEVs和PPMO的协同作用，EPPMO组显示出显著增强的表达，血管生成有助于维持细胞代谢和增殖，从而促进糖尿病伤口愈合。 采用Masson染色来分析皮肤修复中的胶原沉积，如图10c所示，在第3天和第7天，空白组仅表现出少量胶原表达（蓝色）。EO和PPMO水凝胶组已经开始胶原沉积，而EPPMO水凝胶显示出显著的胶原沉积。在第14天，空白组和OQ组均显示出胶原表达，而含有活性物质的EO、PPMO和EPPMO水凝胶显示出更显著的胶原表达，且EPPMO组的胶原排列紧密且成熟。

图10. 组织学免疫荧光和Masson染色。（a）IL-10和TNF-α的免疫荧光染色。（b） α-SMA和CD31的免疫组化染色。（c）Masson染色。（d）IL-10免疫荧光染色的荧光面积的半定量结果。（e）TNF-α免疫荧光染色的荧光面积的半定量结果。（f）CD31免疫荧光染色的荧光面积的半定量结果