针对上述问题，浙江大学张宁、贺永团队开发了基于螺旋微针贴片（T-MN@EXO@miR-378）的药物缓释递送系统，用于治疗IVDD的纤维环损伤。研究制备了负载 EXO@miR-378 的螺纹微针，其基于 SiIMA 复合层粘连蛋白。SiIMA 的高硬度使微针贴片紧密贴合受损纤维环，层粘连蛋白可吸附并缓慢释放外泌体。T-MN 递送 EXO@miR-378 能恢复 AF 细胞的线粒体自噬功能和 ECM 稳态，展现出修复受损纤维环的独特优势。该研究为基于线粒体自噬恢复的长期治疗策略提供新思路，为 IVDD 临床治疗带来新可能。相关成果于 2024 年 3 月 13 日以《Thread-structural microneedles loaded with engineered exosomes for annulus fibrosus repair by regulating mitophagy recovery and extracellular matrix homeostasis》为题发表于《Bioactive Materials》。（DOI：10.1016/j.bioactmat.2024.03.006）。

图1 T-MN@EXO@miR−378的制备与作用机制。（a）T-MN@EXO@miR−378和工程化外泌体制备示意图；（b）T-MN@EXO@miR−378可持续释放外泌体，调节ECM和线粒体自噬；（c）miR-378调控线粒体自噬途径

（1）纤维环线粒体自噬在椎间盘退变中起保护作用

纤维环（AF）破坏在椎间盘退变（IVDD）中起着至关重要的作用（图2A）。分析GEO数据库单细胞RNA测序数据集GSE199866，比较人类退变AF细胞与正常AF细胞差异表达基因（DEGs）（图2B）。KEGG分析显示，差异基因涉及自噬（SQSTM1/BNIP3/WDR45B/CTSL/UBC/CTSD）和线粒体自噬（SQSTM1/BNIP3/UBC/ATF4）通路（图2C）。推测自噬和线粒体自噬在椎间盘保护中重要。

以IL-1β诱导大鼠AF细胞退变模型为实验组，未处理大鼠AF细胞为对照组。RNA测序分析显示，有7个自噬相关差异基因：Foxo1、Tsc1、Em1、Dlc1、Wdfy3、Fos和Map1lc3a（图2D-F）。KEGG分析（图2G）和GO注释分析（图2H）发现，这些自噬相关基因调控细胞过程和生物调节功能，与细胞膜成分密切相关。结果表明，退变AF细胞因自噬损伤导致线粒体膜受损。检测退变AF细胞线粒体自噬水平，发现其显著降低，抑制线粒体自噬的蛋白PINK1表达增加35%，促进线粒体自噬的蛋白Parkin和LC3II/I分别减少25%和20%。Fundc1是编码选择性自噬和线粒体自噬相关蛋白的基因，实验组中Fundc1蛋白表达水平下降49%（图2I和J）。表明AF退变模型中，AF细胞线粒体自噬功能受损。

为研究自噬对IVDD影响，构建Fundc1敲除（KO）小鼠，通过尾椎穿刺疾病模型验证其作用（图2K）。HE染色显示，Fundc1-KO受伤组椎间盘结构损伤更明显，椎间盘高度下降更显著（图2L）。SO染色显示，Fundc1-KO受伤组AF软骨成分减少更明显（图2M）。结果证明，线粒体自噬在退变AF细胞中起关键保护作用。

图2 线粒体自噬相关基因在变性纤维环细胞中的变化及其在IVDD中的保护作用。（A）IVDD示意图；（B）人体IVD数据集Umap；（C）人IVD中变性AF细胞与正常AF细胞DEG的KEGG富集分析；（D）体外大鼠IVD对照组与实验组mRNA转录谱热图；（E）实验组与对照组DEG火山图；（F）对照组与实验组参与自噬DEG的mRNA转录谱热图；（G）对照组与实验组参与自噬DEG的mRNA转录谱KEGG富集分析；（H）对照组与实验组参与自噬DEG的mRNA转录谱GO注释图；（I）实验组与对照组线粒体自噬特征蛋白蛋白表达；（J）蛋白表达定量；（K）Fundc1 KO小鼠、IVDD模型及采样过程示意图；（L）各组HE染色图像；（M）各组番红O染色图像

（2）T-MN@EXO@miR-378的制备与表征

为将药物递送至纤维环深层组织，设计微针（MN）结构并采用3D打印技术制作模具，选择甲基丙烯酰化丝素蛋白（SiIMA）作为微针主要材料以贴合纤维环刚性结构（图3A）。设计类似锥形螺纹的螺纹结构微针，可增加摩擦力，使微针贴片牢固固定在组织上，防止髓核渗漏，同时增大与纤维环接触面积，增加药物释放面积（图3B）。为提高T-MN持续释放外泌体能力，引入层粘连蛋白吸附外泌体，其长臂末端可与外泌体上整合素和生长因子相互作用（图3C）。层粘连蛋白吸附作用和水凝胶内部多孔结构使外泌体渗透到T-MN内部并附着在表面（图3D）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实层粘连蛋白与SiIMA成功混合，SiIMA酰胺I、II和III带峰分别出现在1637、1515和1237 cm⁻¹处，与β折叠构象一致，混合后SiIMA酰胺带转变为α螺旋构象，层粘连蛋白使SiIMA峰蓝移并增强峰强度，利于吸附外泌体。如图3D-F所示，25% SiIMA溶胀率最低，因高浓度下交联度高，孔隙小。应选孔隙率最高浓度确保药物/因子释放，但溶胀过大易使T-MN移位或突出，引发局部炎症。测试四种不同浓度水凝胶的拉伸和压缩模量，随SiIMA浓度增加，模量均上升（图3G和H）。综合考虑溶胀性能和机械性能，选20% SiIMA作为主要成分。T-MN针尖强度重要，检测单根针断裂力（图3I），20% SiIMA T-MN可承受超0.4 N力，能刺入纤维环表层。为验证T-MN贴片粘附效果，进行剥离实验（图3J），T-MN贴片最大剥离粘附力为0.47 N，是无微结构贴片的1.6倍。

验证外泌体和EXO@miR-378表征，通过超声震荡法将miR-378加载到外泌体中。超声震荡法使外泌体膜轻微形变（图3K），外泌体尺寸约100 nm（图3L），表面蛋白CD81和TSG101阳性，阴性蛋白Calnexin未表达，证明外泌体纯度（图3M）。将EXO@miR-378与DID染料溶液共染色1小时后，与T-MN针尖部分孵育24小时，共聚焦显微镜扫描显示EXO@miR-378吸附在T-MN表面（图3N）。研究人员成功构建适应纤维环结构并携带EXO@miR-378的T-MN@EXO@miR-378系统。

图3 T-MN@EXO@miR−378的制备和表征。（A）制备程序；（B）（i）PDMS模具微孔SEM图像，（ii）单个微孔SEM图像，（iii）miR−378处T-MN@EXO的SEM图像，（iv）单个T-MN@EXO@miR−378的SEM图像；（C）SilMA-层粘连蛋白水凝胶溶液制备；（D）不同浓度（i）10%，（ii）15%，（iii）20%，（iv）25%的SilMA水凝胶微观孔SEM图像；（E）SilMA、层粘连蛋白和SilMA-层粘连蛋白的FTIR光谱；（F）不同浓度SilMA水凝胶随时间的溶胀率；（G）不同浓度SilMA水凝胶的拉伸应力-应变曲线和模量；（H）不同浓度SilMA水凝胶的压缩应力应变曲线和模量；（I）不同浓度SilMA水凝胶单根微针的力-位移曲线和断裂力；（J）具有T-MN结构和不具有MN结构的贴片的剥离力和剥离粘附力；（K）外泌体（EXO）和EXO@miR-378的TEM分析；（L）外泌体和EXO@miR-378的NTA分析；（M）通过蛋白质印迹法对钙调蛋白、TSG 101和CD 81的外泌体表征；（N）T-MN和T-MN@EXO@miR−378的荧光图像（红色：T-MN；绿色：外泌体）

（3）T-MN@EXO@miR-378调控细胞外基质代谢和纤维环细胞迁移

将T-MN@EXO@miR-378倒置于培养基中，使EXO@miR-378释放并被纤维环细胞摄取（图4A）。分别用T-MN、T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378预处理纤维环细胞后与IL-1β共培养24小时。结果显示，T-MN@EXO组使纤维环细胞MMP13表达降低42%，T-MN@EXO@miR-378组降低49%（图4B），表明二者均能抑制细胞对细胞外基质的降解。T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378分别使Col I表达增加72%和150%（图4C），证明T-MN@EXO@miR-378在退变环境下促进细胞外基质合成的能力优于T-MN@EXO，免疫荧光检测结果一致（图4D和E）。为验证T-MN@EXO@miR-378对纤维环细胞迁移的影响，在培养皿底部划线模拟细胞缺损，观察12小时和24小时后细胞迁移距离。结果显示，T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378组迁移距离较IL-1β组增加近三倍（迁移率提高35%）（图4F-H）。

图4 T-MN@EXO@miR−378对细胞外基质（ECM）合成与分解及纤维环（AF）细胞迁移的影响。（A）T-MN@EXO@miR−378对AF细胞作用的示意图；（B）各组Col I、Col II、聚集蛋白聚糖和MMP13的蛋白表达；（C）Col I和MMP13蛋白表达的定量分析；（D）各组MMP13的荧光图像；（E）各组IL-1β刺激后Col I的荧光图像；（F）各组的迁移实验；（G）各组12小时和24小时迁移率的定量分析，数据以均数±标准差（n=3）表示，与IL-1β+PBS组相比，*p<0.05，**p<0.01

（4）T-MN@EXO@miR-378促进纤维环细胞线粒体自噬

采用JC-1试剂盒检测发现，T-MN@EXO使退变纤维环细胞JC-1聚集体/单体比值提高275%，T-MN@EXO@miR-378可恢复至对照组水平的92%（图5A）。线粒体形态观察显示，退变纤维环细胞线粒体嵴空泡化，T-MN@EXO@miR-378处理后部分恢复至正常形态（图5C）。Western blot结果显示，T-MN@EXO@miR-378使线粒体自噬抑制蛋白p62和PINK1表达降低，促进蛋白Fundc1表达增加（图5B）。免疫荧光染色显示，T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378均降低p62蛋白表达水平（图5D），增加LC3蛋白表达水平（图5E）。研究还发现，T-MN@EXO@miR-378通过PDK1-Akt通路影响自噬激活（图5F），可降低PDK和pAkt蛋白表达水平，促进FoxO1和FoxO3蛋白表达（图5G）。

图5 T-MN@EXO@miR−378对AF细胞线粒体自噬和功能的影响。（A）各组JC-1荧光图；（B）各组p62、PINK1、Fundc1蛋白表达；（C）各组线粒体透射电镜观察；（D）各组IL-1β刺激后p62的荧光图像；（E）各组IL-1β刺激后LC3的荧光图像；（F）miR-378恢复自噬途径的示意图；（G）各组PDK1、p-Akt、Akt、FoxO1、FoxO3蛋白表达，数据以均数±标准差（n=8）表示，与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01

（5）T-MN@EXO@miR-378持续释放EXO@miR-378促进纤维环修复的体内研究

在大鼠尾椎节段建立纤维环损伤模型，分别给予T-MN、T-MN@EXO和T-MN@EXO@miR-378处理后进行肌皮缝合（图6A和B）。结果显示，受损椎间盘高度随时间降低，术后4周T-MN@EXO@miR-378组椎间盘高度指数（DHI%）较损伤组保留率提高28%，8周时优势更显著（图6D-E）。大体观察显示T-MN@EXO@miR-378组椎间盘形态保持最佳（图6F）。DID荧光标记检测外泌体缓释特性，负载层粘连蛋白的T-MN组第1天外泌体滞留能力显著，7天后含量仍高于无层粘连蛋白组（图6G）。安全性评估显示，T-MN@EXO@miR-378长期滞留未引起心、肝、脾、肾等器官炎症反应（图6H），血液生化指标检测表明该治疗系统对重要器官功能无显著影响（图6I）。

图6 T-MN@EXO@miR−378对椎间盘高度的保护作用及体内外泌体释放特性。（A）大鼠椎间盘退变（IVDD）修复中T-MN@EXO@miR−378的示意图；（B）手术示意图；（C）椎间盘高度指数（DHI）的计算方法；（D）各组4周和8周时的椎间盘X线图像；（E）4周和8周时DHI的评估；（F）各组椎间盘的外观视图；（G）DID标记的外泌体在第1、3、7天的体内外泌体荧光强度；（H）对照组和T-MN@EXO@miR−378组的心脏、肾脏、脾脏和肝脏的HE染色图像；（I）血生化指标（Ca、CRE、ALP、Na、K、Cl、GOT/GPT、BUN）与对照组的相对表达

（6）T-MN@EXO@miR-378恢复纤维环细胞外基质稳态和线粒体自噬的体内研究

对各组进行苏木精-伊红（HE）和番红O-固绿（SO）染色。组织学分析显示，SO染色中T-MN@EXO@miR-378组能更好地保护内层纤维环和髓核的软骨成分（红色区域）（图7A），HE染色结果显示各组椎间盘状态的变化（图7B）。免疫组化（IHC）染色分析证实，损伤组中线粒体自噬促进蛋白（Fundc1、Parkin）表达较低，而线粒体自噬抑制蛋白（PINK1）表达较高，T-MN@EXO@miR-378能促进线粒体自噬促进蛋白的表达，同时抑制线粒体自噬抑制蛋白的表达，从而调节ECM稳态（图7C和D）。在Fundc1基因敲除（KO）小鼠中建立椎间盘穿刺模型，结果显示，纤维环受损的Fundc1 KO小鼠的线粒体自噬功能受损更严重，ECM损伤也更显著（图7E和F）。

图7 T-MN@EXO@miR−378对ECM合成、分解及体内线粒体自噬的影响。（A）各组番红O染色图像；（B）各组HE染色图像；（C）各组MMP13和Col I的免疫组化检测；（D）各组Fundc1、Parkin和PINK1的免疫组化检测；（E）WT、FUNDC1 KO、WT-损伤和FUNDC1-KO-损伤组的MMP13和Col I的免疫组化检测；（F）WT、FUNDC1-KO、WT-损伤和FUNDC1-KO-损伤组的Fundc1、Parkin和PINK1的免疫组化检测