为此研究人员该研究开发了一种名为CRUPPA19的纳米声敏剂，通过将铜配合物封装到具有Z型异结构的UiO-66-NH2中，并修饰上mPEG-PO3和抗CD19抗体，使其能够特异性靶向B细胞淋巴瘤（BCL）细胞。在超声照射下，CRUPPA19可以产生活性氧（ROS）诱导细胞凋亡，并通过自噬释放铜和大黄素，分别导致铜死亡和PDL1转录抑制，从而协同诱导免疫原性细胞死亡，激活CD8+T细胞，引发抗淋巴瘤免疫反应。该疗法不仅清除了原发性和转移性淋巴瘤，还能清除骨髓中的淋巴瘤细胞，为基于MOF的纳米表观遗传治疗平台提供了新思路，展现了超声触发级联放大作用在增强抗血液肿瘤免疫力方面的潜力。该文章于2025年2月7日以《UiO-66 MOFs-Based “Epi-Nano-Sonosensitizer” for Ultrasound-Driven Cascade Immunotherapy against B-Cell Lymphoma》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c15761）。

研究示意图

（1）CuR@UiO66 的构建与表征

合成了CuRhein复合物（图1A）。Cu(II)形成正方形平面几何结构，与两个Rhein分子的1-羟基-9-酮基团配位。1692和1266 cm–1处的峰分别对应-C═O和-C–OH基团的振动伸缩，其强度变化和位置偏移表明Cu(II)与Rhein之间存在相互作用。与Rhein相比，CuRhein的吸收强度更强，延伸至近750 nm。如图1B所示，Rhein在可见光区域的最大吸收带位于428 nm，而CuRhein的吸收带出现在480 nm。这种红色位移归因于羟基蒽醌二阴离子的生成和Cu(II)中心的诱导效应。铜莱茵的荧光强度更高，表明与Cu(II)配位后生成了更大的共轭物（图1C）。

将CuRhein封装入UiO-66-NH₂中，生成高声动力活性的纳米平台。CuR@UiO66采用两步法合成（图1D）。透射电子显微镜（TEM）显示CuR@UiO66纳米晶体具有良好的八面体形态（图1E）。动态光散射（DLS）测量显示，UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的颗粒尺寸分别为230.7±5.4和240.9±6.1 nm（图1F）。CuR@UiO66的粉末X射线衍射（PXRD）图案与UiO-66-NH₂相似，表明CuRhein的封装未影响UiO-66-NH₂的结构完整性（图1G）。CuR@UiO66的元素映射证实了Zr、Cu、O、N和C的存在以及CuRhein的成功负载（图1H）。UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的FTIR光谱如图S5所示。CuR@UiO66显示出C═O和C–O的额外吸收峰，分别对应于1629和1285 cm–1的振动伸缩，这与CuRhein的引入一致。CuRhein的最大负载效率为98%，在CuRhein/CuR@UiO66质量比为0.1:1时，负载容量（LC）为9.8%（图S6）。为了匹配临床剂量，选定的CuRhein负载纳米载体的最终浓度为15μg/mL（25μM），纳米颗粒溶液的总浓度为100μg/mL。

为了评估CuRhein与MOF之间的相互作用，通过X射线光电子能谱(XPS)对UiO-66-NH₂、CuRhein和CuR@UiO66的化学状态进行了表征。CuR@UiO66的Zr 3d XPS光谱显示两个明显的峰，分别位于186.1和183.7 eV，对应于3d₃/₂和3d₅/₂杂化轨道（图1I）。与UiO-66-NH₂相比，CuR@UiO66的Zr 3d₃/₂和3d₅/₂峰向左移动了0.5 eV，其N 1s峰向左移动了0.2 eV（图1J）。与纯CuRhein相比，CuR@UiO66的Cu 2p₁/₂和2p₃/₂峰分别向右移动了0.3 eV至954.5和935.0 eV（图1K）。结果表明，与CuRhein相比，CuR@UiO66的Cu 2p状态电子更多，而与UiO-66-NH₂相比，CuR@UiO66的Zr 3d状态电子更少，这可能是由于从UiO-66-NH₂到CuRhein的电子转移引起的。

图1. CuR@UiO66的合成和表征。（A）CuRhein合成示意图；（B）CuRhein和Rhein的紫外-可见吸收光谱；（C）CuRhein和Rhein的荧光光谱；（D）CuR@UiO66的合成；（E）CuR@UiO66的透射电子显微镜（TEM）图像；（F）UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的流体动力学粒径；（G）UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的X射线衍射（XRD）图谱；（H）CuR@UiO66的扫描透射电子显微镜（STEM）图像及其相应的元素映射；UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的高分辨率X射线光电子能谱（XPS）显示（I）Zr 3d峰，（J）N 1s峰和（K）Cu 2p峰

（2）铜纳米粒子@UiO66的声动力机制

铜R@UiO66的声动力性能通过使用2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）作为捕获剂，通过电子自旋共振（ESR）光谱测量¹O₂的产生来测试。在未照射的CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66中未检测到¹O₂的特征1:1:1三重峰，而在CuRhein和UiO-66-NH₂中观察到微弱的峰，这表明在超声照射（1 W/cm²，1 MHz，50%占空比，5分钟）后，¹O₂的产生较弱。另一方面，照射的CuR@UiO66出现了明显的1:1:1三重峰，表明将CuRhein封装到UiO-66-NH₂中增强了超声触发的¹O₂产生（图2A,B）。这些结果进一步使用单线态氧传感器绿色（SOSG）（图2C）和1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）探针分别得到证实（图2D）。使用亚甲基蓝（MB）探针检测到超声激活的CuR@UiO66产生的羟基自由基（•OH）（图2E和S11）。超声激活的CuR@UiO66产生的•OH比其他组更高。

为了进一步探索CuR@UiO66相较于CuRhein或UiO-66-NH₂具有更高声动力性能的机制，分析了它们的光学吸收性质和能带结构。UiO-66-NH₂、CuRhein和CuR@UiO66的紫外-可见光（UV-vis）漫反射光谱（DRS）表明，CuR@UiO66的吸收发生了显著的红移，这可以归因于UiO-66-NH₂和CuRhein的协同作用（图2F）。通过基于它们的吸收光谱的Tauc图确定了UiO-66-NH₂、CuRhein和CuR@UiO66的带隙（图2G）。Mott-Schottky（M-S）测量表明，UiO-66-NH₂、CuRhein和CuR@UiO66的平带位置分别为-0.60、-0.91和-0.63 V vs Ag/AgCl（图2H-J）。为了进一步了解CuR@UiO66的电子结构，使用了密度泛函理论（DFT）来确定表面电荷密度（图2K）。铜R@UiO66的差分电荷密度计算表明，UiO-66-NH₂表面C原子（蓝色）周围的电子密度降低，而CuRhein中Cu原子（黄色）周围的电子密度增加，表明电子从UiO-66-NH₂转移到CuRhein。提出了CuRhein的Z型机制，如图2L所示。在超声刺激下，CuRhein和UiO-66-NH₂都被激发并产生电子-空穴对。由于最低未占据分子轨道（LUMO）电位（-0.81 V vs正常氢电极（NHE））比O₂/•O₂⁻氧化还原电位（-0.33 V vs NHE）更负，CuRhein优先产生¹O₂。另一方面，由于最高占据分子轨道（HOMO）电位（+2.42 V vs NHE）比H₂O/•OH氧化还原电位（+2.38 V vs NHE）更正，UiO-66-NH₂更有利于产生•OH。此外，CuRhein不能产生•OH产物，因为CuRhein HUMO电位高于H₂O/•OH氧化还原电位。总体而言，在超声照射过程中，电子从UiO-66-NH₂转移到CuRhein是通过高效率的电子途径实现的，而空穴被限制在UiO-66-NH₂的HOMO中，导致电子-空穴对的效率空间分离。

图2. CuR@UiO66通过超声刺激产生ROS的机制。（A）非辐照的CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66产生的TEMP/¹O₂的ESR光谱；（B）超声辐照的CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66产生的TEMP/¹O₂的ESR光谱；（C）SOSG的归一化荧光强度，表明在超声辐照下（1 W/cm²，1 MHz，50%占空比）磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66产生¹O₂；（D）DPBF的归一化紫外-可见吸收，表明在超声辐照下（1 W/cm²，1 MHz，50%占空比）PBS、CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66产生¹O₂（有/无超声辐照）；（E）MB的归一化紫外-可见吸收，表明在超声辐照下（1 W/cm²，1 MHz，50%占空比）PBS、CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66产生·OH，数据为平均值±标准偏差（SD）；（F）CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的紫外-可见漫反射光谱；（G）CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的带隙；（H-J）CuRhein、UiO-66-NH₂和CuR@UiO66的Mott-Schottky（M-S）图；（K）CuR@UiO66的电荷密度；（L）CuR@UiO66在超声辐照下产生ROS的Z型机制示意图

（3）CuR@UiO66选择性靶向B淋巴细胞

为了提高CuR@UiO66对B淋巴瘤细胞的靶向能力，将抗CD19抗体与CuR@UiO66偶联，并引入mPEG-PO3以增强生物相容性，得到纳米复合材料CRUPPA19（图3A）。用DPBF和MB探针检测活性氧证实，这些改性不会影响其声动力活性。使用共聚焦显微镜评估Cy3标记的CRUPPA19在A20细胞和原代单核细胞中的摄取情况（图3B）。结果表明，CRUPPA19可以被CD19过表达的B淋巴细胞选择性摄取。细胞内的Rhein在发射520 nm（激发488 nm）时检测到绿色荧光。用CRUPPA19处理的A20细胞在无超声刺激时无绿色荧光信号，而超声照射后荧光增强（图3C），表明超声触发了Rhein的释放。电感耦合等离子体质谱原子发射光谱法（ICP-AES）定量细胞内锆含量进一步证实了这一点（图S18）。共聚焦显微镜共定位分析显示，超声激活后CRUPPA19可进入自噬体（图3D）。通过体外荧光成像和ICP-MS测量不同组织中的锆含量，评估CRUPPA19在A20肿瘤携带小鼠中的生物分布（图3E）。CRUPPA19纳米颗粒用Cy7标记以进行体内成像。结果显示，CRUPPA19在肝脏和脾脏中积累较少，而在肿瘤组织和骨髓中的锆含量和Cy7荧光强度在给药后30分钟达到峰值（图3F–H），表明其可以靶向淋巴瘤组织和骨髓微环境。流式细胞术分析显示，从骨髓中分离出的CD19+淋巴瘤细胞中存在强烈的Cy7信号（图3I、J），进一步证实了CRUPPA19的归巢能力。总之，CRUPPA19的高稳定性、生物相容性和淋巴瘤靶向能力使其成为治疗BCL的理想纳米药物。

图3. CRUPPA19可选择性靶向B淋巴细胞。（A）通过将抗CD19抗体和mPEG-PO₃结合到CuR@UiO66中，说明CRUPPA19合成的示意图；（B）显示A20细胞和正常单核细胞（L929）在孵育30分钟后，Cy3标记的CRUPPA19（红色荧光）摄取的代表性荧光图像，细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）染色，比例尺=20 µm；（C）分别培养额外30分钟和2小时的CRUPPA19或CRUPPA19+US处理的A20细胞的荧光图像，比例尺=20 µm；（D）CRUPPA19或CRUPPA19+US处理的A20细胞自噬体转位分析1小时，比例尺=20 µm；（E）建立小鼠BCL模型和评估体内CRUPPA19分布的示意图；（F）肿瘤携带小鼠的代表性原位荧光图像，显示Cy7标记的CRUPPA19或CRUPP的生物分布；（G）在静脉注射CRUPPA19或CRUPP后24小时，肿瘤、股骨（TB）和主要器官的代表性荧光图像；（H）肿瘤、骨髓（BM）和其他主要器官中Zr含量的变化，表明NPs的生物分布；（I，J）从携带A20小鼠骨髓中提取的淋巴瘤细胞（CD19⁺）中，Cy7标记的CRUPPA19摄取的流式细胞术分析

（4）超声触发的CRUPPA19级联放大以诱导淋巴瘤细胞死亡

使用2,7-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测了CRUPPA19处理的A20细胞内活性氧（ROS）产生情况。结果显示，经CRUPPA19处理并超声照射后的细胞荧光强烈，表明ROS产生量高（图4A）。通过Annexin V-FITC和7-氨基放线菌素D（7-AAD）双重染色检测细胞凋亡情况，发现CRUPPA19+US处理的细胞凋亡率为54%（早期和晚期凋亡的总和），显著高于其他组（图4B）。使用pCMV-mCherry-GFP-LC3B质粒报告系统量化自噬通量，结果显示CRUPPA19在超声照射下以剂量依赖性方式诱导自噬，而未经照射的CRUPPA19组则缺乏自噬诱导（图4C）。CRUPPA19+US治疗后，自噬特异性底物p62显著下调（图4D），表明自噬被有效诱导。分析CRUPPA19处理的细胞中相关生物标志物的表达水平，发现CRUPPA19介导的声动力治疗（SDT）以剂量依赖性方式导致脂酰化的DLAT寡聚化，铁氧还蛋白1（FDX1）和脂酰合酶（LIAS）的表达下调（图4D）。分析CRUPPA19处理的A20细胞中程序性死亡配体1（PDL1）的表达情况，发现CRUPPA19+US显著降低了PDL1表面蛋白水平（图4E）。进一步的m6A点印迹（图4F）、液相色谱-质谱联用（LC/MS）（图4G）和基因特异性m6A qPCR（图4H）显示，CRUPPA19+US增加了全局m6A RNA甲基化，降低了PDL1转录本（图4I）和PDL1蛋白表达稳定性。总体而言，CRUPPA19在超声照射下触发细胞内级联反应，导致多模态程序性细胞死亡（图4J）。

图4. US触发的CRUPPA19级联放大以诱导淋巴瘤细胞死亡。（A）用细胞内¹O₂探针DCFH-DA染色的不同处理A20细胞的代表性荧光图像，标尺=50 µm；（B）流式细胞术图显示经指定处理后annexin V-FITC/7-AAD阳性A20细胞的百分比；（C）绿色荧光蛋白（GFP）/红色荧光蛋白（RFP）比率，表明在适当处理的A20细胞中，经GFP-LC3-RFP报告基因转染后的自噬通量，GFP/RFP比率增加表示自噬通量减少；（D）Western印迹显示A20细胞在1 W/cm²的US照射下，经不同剂量的CRUPPA19处理5分钟后，铜死亡或自噬相关蛋白的表达；（E）经指定剂量CRUPPA19处理的A20细胞的表面PD-L1表达；（F）点印迹和（G）液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定经指定剂量CRUPPA19处理的A20细胞中的m⁶A mRNA水平；（H）特异性m⁶A定量聚合酶链反应（qPCR）显示经CRUPPA19指定剂量处理的A20细胞中PD-L1 m⁶A-mRNA水平；（I）PD-L1 mRNA稳定性实验：A20细胞用CRUPPA19（100 µg/mL）预处理24小时，然后与放线菌素D（Act-D）孵育指定时间，收集细胞并进行qPCR检测；（J）说明CRUPPA19在体外声动力效应的示意图

使用A20 B淋巴细胞瘤细胞在小鼠中建立双边肿瘤模型（图5A）。将A20细胞移植到每只小鼠的右侧腹部建立原发肿瘤，并在24小时后在左侧腹部建立继发肿瘤。当肿瘤生长到约250 mm³时，将小鼠随机分为11组（每组6只），分别用不同方法治疗。结果显示，PBS和PBS+US组肿瘤快速双边生长，所有小鼠在23天内死亡。UPPA19介导的声动力治疗（SDT）仅抑制原发肿瘤生长10.8%，对远处肿瘤影响弱，导致接种后27天内100%死亡率。Rhein对原发和继发肿瘤分别实现20.5%和17.6%的生长抑制。CuRhein+US治疗导致双侧肿瘤生长抑制（TGI）27.3%和24.5%，并使小鼠生存期延长至38天。抗PDL1和抗CD20抗体治疗的双侧TGI率分别为33.2%和49.7%，生存期分别为37天和43天（P<0.05）。CRUPPA19在无US刺激时对肿瘤生长无明显抑制作用，但CRUPPA19+US实现了初级肿瘤的近完全消融，并抑制了90.4%的远处肿瘤生长，所有小鼠均存活至第80天（图5B-F）。病理染色证实，CRUPPA19+US显著降低了双侧肿瘤组织中PCNA阳性细胞的比例（分别降低了94.6%和95.5%）。CRUPPA19+US显著降低了骨髓中CD19+淋巴细胞的浸润，降低了94.7%（图5G，I），表明其可以消除骨髓深处的游离淋巴瘤细胞。此外，CRUPPA19+US还逆转了肿瘤小鼠的脾肿大（图5H，J）。

评估CRUPPA19在超声照射下的免疫治疗机制，发现接受CRUPPA19和超声照射治疗的小鼠在原发肿瘤组织中HMGB1、CRT和ATP的表达水平高出5倍（图5K），证实了CRUPPA19介导的SDT触发了肿瘤中的免疫原性细胞死亡（ICD）。CRUPPA19+US显著增加了CD80+CD86+成熟DCs的比例至54.3%（图5L），并增加了肿瘤内CD8+T细胞的浸润至27.0%（图5M）。该组中IFN-γ的血清水平最高（图5P），且肿瘤组织中PDL1表达最低，m6A-mRNA水平最高（图5N、O）。这些结果表明，CRUPPA19介导的SDT通过全局m6A-mRNA甲基化下调PDL1，激活T细胞，促进DC成熟并增强CD8+T细胞的肿瘤识别能力。

图5. CRUPPA19在淋巴瘤小鼠模型中的超声免疫治疗效应。（A）说明A20双侧肿瘤模型建立和CRUPPA19介导的超声免疫治疗的时间表。（B）所示组别原发肿瘤和（C）远处肿瘤的生长曲线。（D）所示组别原发肿瘤和（E）远处肿瘤的TGI比率。（F）显示不同处理A20携带小鼠80天总生存概率的Kaplan-Meier曲线。（G）接受者小鼠Wright-Giemsa染色骨髓（BM）涂片的代表性图像。标尺=20μm。（H）所示组别脾脏和相应的苏木精和伊红（H&E）染色组织切片的代表性图像。标尺=1 cm（脾脏图像）；100μm（H&E染色）。（I）所示组别A20携带小鼠中CD19+淋巴瘤细胞的百分比。（J）所示组别脾脏重量。（K）所示组别原发肿瘤中HMGB1的相对表达水平。（L）所示组别远处肿瘤中成熟DCs的百分比（CD80+CD86+细胞在CD11c+细胞上筛选）。(M)指示组远端肿瘤中CD8+T细胞（在CD3+T细胞上筛选）的百分比。（N）指示组远端肿瘤中PDL1的表达。（O）通过LC/MS测量的远端肿瘤中m6A mRNA水平。（P）指示组血清中IFN-γ水平