针对上述问题，南开大学余志林教授团队开发了一种酶响应性原位液 - 液相分离系统，用于靶向无膜细胞器以增强癌症化疗效果。研究中利用了肽的刺激响应性以及液滴与应激颗粒（SGs）凝聚的潜在优势。通过在肽中引入硫酸酯酶响应性硫酸化酪氨酸，实现了活细胞中原位相分离的建立。硫酸酯酶是一种在多种癌细胞中异常过表达的溶酶体定位酶，主要在溶酶体中发挥催化活性。研究结果表明，这种原位形成的液滴能够靶向 SGs，通过与 SGs 的凝聚直接抑制其功能，从而解决癌症化疗中的药物耐受性问题。该研究于2025年5月7日以《In Situ Liquid-Liquid Phase Separation of Peptides Into Droplets Targeting Membraneless Organelles for Enhanced Cancer Chemotherapy》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI：10.1002/adma.202420399）。

研究示意图

（1）肽YSO4F的酶响应性LLPS研究

肽 YSO4F 及其天然对应物 YF 合成与纯化后（图 1A），经超高效液相色谱 - 质谱（UPLC-MS）评估 YSO4F 的酶响应性。UPLC 动力学研究显示，加入硫酸酯酶后 YSO4F 逐渐转化为 YF（图 1B、C）。经 YF 相分离的浓度依赖性研究确定酶诱导 LLPS 的条件，光学显微镜显示 YF 在 1.4 mm 浓度下形成液滴（图 1D）。YSO4F 的酶诱导 LLPS 通过先在酸性溶液中孵育肽与硫酸酯酶，再调溶液 pH 至 7.4 进行。相同条件下，单独 YSO4F 呈均质溶液（图 1E），经硫酸酯酶处理后形成明显液滴（图 1F），表明硫酸酯酶诱导 YSO4F 发生 LLPS。YSO4F 与硫酸酯酶孵育并调 pH 至 7.4 后，CLSM 图像显示形成绿色球形液滴（图 1G）。CLSM 图像还显示不同液滴间的融合，两个小液滴在 90 秒内共醋成一个大液滴（图 1H）。以上结果直接证明 YSO4F 在硫酸酯酶诱导酪氨酸残基硫酸根水解后发生酶响应性 LLPS，为在过表达硫酸酯酶的活细胞中原位建立相分离奠定基础。

图1 A) 硫酸化肽 YSO4F 及其天然对应物 YF 的化学结构。B) 硫酸化肽 YSO4F（100 µm）在不同时间用硫酸酯酶（20 U/mL）处理的超高效液相色谱（UPLC）图谱。C) 在酶浓度为 20 U/mL 的条件下，YSO4F（100 µm）中硫酸根水解转化率随时间的变化。D) 不同浓度下肽 YF 的光学显微镜（OM）图像，从左到右：1.3、1.4、1.5、1.6 和 1.8 mm。E，F) 溶液中肽 YSO4F（1.4 mm）在与硫酸酯酶孵育前（E）和 24 小时后（F）的光学显微镜（OM）图像。G) 经硫酸酯酶处理的 YSO4F（1.4 mm）形成的液滴的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，用于说明荧光恢复后光漂白（FRAP）过程。H) 经硫酸酯酶处理的 YSO4F（1.4 mm）形成的液滴融合的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像

（2）肽YSO4F在癌细胞中的摄取与原位LLPS研究

选用过表达硫酸酯酶的鼠乳腺癌细胞系 4T1 作为模型细胞。在相分离研究前，通过流式细胞分析和荧光信号强度定量，发现 4T1 细胞对 YSO4F 的摄取优于 YF（图 2A、B），推测与其不同的摄取途径有关。由于硫酸酯酶在驱动原位 LLPS 过程中的关键作用及其在溶酶体中的催化微环境，研究了 YSO4F 的内化途径。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示 YF 和 YSO4F 被 4T1 细胞成功摄取（图 2C）。YSO4F 处理的 4T1 细胞中，肽 FITC 与溶酶体示踪剂信号的皮尔逊相关系数（PCC）值最初约为 0.73，12 小时后降至 0.23（图 2D），表明肽与溶酶体的共定位及其溶酶体逃逸，阐明了 YSO4F 的溶酶体介导摄取途径。YSO4F 经硫酸酯酶诱导水解为带正电的 YF 后，可能通过质子海绵效应促进溶酶体逃逸。此外，CLSM 图像显示 4T1 细胞内形成球形液滴，经 FRAP 研究发现，肽溶酶体逃逸后，4T1 细胞内的绿色液滴在光漂白后荧光恢复强劲（图 2E），表明 YSO4F 在 4T1 细胞内发生原位相分离形成液滴。

图2 A) 通过流式细胞分析法分析 4T1 细胞在不同时间点摄取 1.4 mM 的肽 YSO4F 和 YF。B) 流式细胞实验中，4T1 细胞与 YSO4F 或 YF 共孵育后的定量荧光强度。C) 4T1 细胞在 1.4 mM YSO4F 存在下孵育 2、4、8 和 12 小时的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，用 Lyso-Red 荧光示踪剂染色。D) 用 YSO4F 或 YF 处理的 4T1 细胞在不同时间点，Lyso-Red 荧光示踪剂与 FITC 信号之间的皮尔逊相关系数（PCC）值。E) 用 YSO4F 处理 12 小时的 4T1 细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，以确认原位形成液滴的荧光恢复后光漂白（FRAP）特性

（3）基于酶诱导原位 LLPS 系统的亚细胞结构靶向功能研究

将 YSO4F 与 TPP-YSO4F 按 9:1 摩尔比混合，制备了混合物 m-YSO4F-Lm（图 3A），其中 m 表示混合物，Lm 表示靶向线粒体的配体。，证实了其酶诱导的 LLPS。同样，通过混合 YF 和 TPP-YF 制备了含配体的液滴 d-YF-Lm。通过监测肽 FITC 与线粒体示踪剂信号的共定位，评估了形成的液滴的线粒体靶向特性（图 3B）。CLSM 图像显示，m-YSO4F-Lm 处理 12、16 和 20 小时后，FITC 与线粒体示踪剂信号的 PCC 值逐渐增加（图 3C），表明液滴在细胞质中围绕线粒体积累。通过 MTT 实验评估了 m-YSO4F-Lm 对癌细胞的毒性及其诱导细胞死亡的机制。结果表明，YSO4F、m-YSO4F-Lm 和 d-YF-Lm 均能略微降低 4T1 细胞的活性（图 3D），其中 m-YSO4F-Lm 由于其增强的细胞摄取和线粒体靶向特性，对 4T1 细胞表现出较高的毒性。由于靶向配体在毒性中的关键作用，通过监测线粒体的完整性来探究 m-YSO4F-Lm 杀死癌细胞的机制。CLSM 图像显示，经 m-YSO4F-Lm 处理 24 小时的 4T1 细胞中出现强烈的绿色荧光信号，表明线粒体去极化，从而导致细胞凋亡（图 3E）。通过流式细胞实验定量分析了不同处理下 4T1 细胞中红色和绿色荧光信号的强度比值，结果表明，经 m-YSO4F-Lm 处理的 4T1 细胞中 J - 聚集体显著减少（图 3F），证明了线粒体去极化和功能障碍是细胞凋亡的原因。总体而言，研究表明原位形成的共醋液滴具有线粒体靶向特性，可诱导细胞凋亡。

图3 A) 通过 YSO4F 与配体 TPP-YSO4F 混合制备液滴前体混合物 m-YSO4F-Lm 及其在 4T1 细胞中原位相分离成液滴 d-YF-Lm 以靶向线粒体并诱导细胞死亡的示意图。B) 用 Mito-Red 染色线粒体后，经 m-YSO4F-Lm（1.4 mm）处理 12、16 和 20 小时的 4T1 细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。C) 用 YSO4F 或 m-YSO4F-Lm 处理的 4T1 细胞在不同时间点，Mito-Red 荧光示踪剂与 FITC 信号之间的皮尔逊相关系数（PCC）值。D) 4T1 细胞经 YSO4F、d-YF-Lm 和 m-YSO4F-Lm 在不同浓度下处理 24 小时后的细胞活性。E) 用 JC-1 标记的 4T1 细胞经 m-YSO4F-Lm（1.4 mM）处理 0、6、12、18 和 24 小时后的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。F) 用不同处理孵育的 JC-1 标记的 4T1 细胞中，与 J-聚集体（红色）和 J-单体（绿色）信号相关的荧光强度比值的流式细胞分析结果

（4）无膜应激颗粒靶向功能研究

完成膜细胞器靶向研究后，进一步探索了原位 LLPS 系统对无膜应激颗粒（SG）的靶向功能。合成与 G3BP2 具有可靠亲和力的配体 FGDF-YSO4F 和 FGDF-YF，将其与亲本肽混合，得到混合物 m-YSO4F-LSG 和液滴 d-YF-LSG（图 4A）。微量热泳动（MST）研究显示 FGDF-YF 与 G3BP2 的结合常数为 21.6 µm，表明其对 SG 具有潜在靶向活性（图 4B）。在 MST 研究中，固定 YF 浓度为 1.4 mm 维持液滴结构，将 FGDF-YF 浓度设置为与单独配体 MST 研究相同范围，结果显示配体加入液滴 d-YF-LSG 后，配体 - 蛋白结合增强 3.9 倍（图 4C），表明液滴募集配体和蛋白，促进它们结合。根据 MST 结合曲线，配体与蛋白结合在 FGDF-YF 浓度 70 - 100 µm 时达到稳定平台阶段，因此以 5% 含量将配体混入混合物或液滴中（图 4A）。MTT 实验显示，YSO4F、m-YSO4F-LSG 或 d-YF-LSG 处理 A549 细胞未显著降低细胞活性（图 4D），表明肽对癌细胞细胞毒性低。索拉非尼对 A549 细胞表现出中等细胞毒性，半致死剂量（IC50）值约为 13 µm（图 4E）。然而，m-YSO4F-LSG 或 d-YF-LSG 预处理 A549 细胞后，再与索拉非尼共孵育，导致显著细胞死亡，特别是 m-YSO4F-LSG 与索拉非尼联合处理使索拉非尼 IC50 值降至 3 µm，表明原位形成液滴具有细胞毒性增敏作用。m-YSO4-LSG 存在下孵育 A549 细胞，再用索拉非尼刺激，导致 A549 细胞内明显形成共醋液滴（图 4F），线扫描分析显示肽 FITC 和 G3BP2-IF 染色信号显著重叠。相比之下，YSO4F 孵育的 A549 细胞（也在 A549 细胞中形成共醋液滴）未显示 FITC 和 IF 染色信号重叠（图 4G），结果强有力地表明原位形成液滴与蛋白 G3BP2 重叠源于配体与蛋白 G3BP2 结合。

图4 A) 通过 YSO4F 与配体 FGDF-YSO4F 混合制备混合物 m-YSO4F-LSG 及其在 A549 细胞中原位 LLPS 形成液滴 d-YF-LSG 以靶向应激颗粒（SG）并诱导细胞死亡的示意图。B, C) 微量热泳动（MST）实验曲线显示配体 FGDF-YF（B）或液滴 d-YF-LSG（C）与蛋白 G3BP2 的结合亲和力随配体浓度的变化。D) A549 细胞经 YSO4F、d-YF-LSG 或 m-YSO4F-LSG 处理 24 小时后的细胞活性。E) A549 细胞单独用索拉非尼（Sor：1）处理 12 小时，或用 YSO4F（2）、FGDF-YSO4F（3）、d-YF-LSG（4）或 m-YSO4F-LSG（5）处理 12 小时后与索拉非尼共孵育 12 小时，其中显示了半致死剂量（IC50）值。F, G) 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示用 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）（F）或 YSO4F（1.4 mm）（G）处理 12 小时并用索拉非尼共孵育 2 小时的 A549 细胞的免疫荧光染色 G3BP2

（5）原位形成液滴的 SG 靶向功能及机制研究

原位形成的液滴通过凝聚整个应激颗粒（SG）或招募单个蛋白 G3BP2 来增强索拉非尼的细胞毒性。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，经 m-YSO4F-LSG 处理并用索拉非尼刺激的 A549 细胞中，肽 FITC 与 T 细胞内抗原 1（TIA-1）免疫荧光染色信号显著共定位（图 5A），表明液滴与整个 SG 的凝聚；而经 YSO4F 处理的 A549 细胞中，绿色 FITC 和红色免疫荧光染色信号完全分离（图 5B），直接证明了原位形成液滴的 SG 靶向特性。CLSM 图像还显示，用 NT-647 荧光染料标记的 G3BP2 与 d-YF-LSG 共孵育后，绿色 FITC 和红色 NT-647 荧光信号高度重叠（图 5C），表明液滴招募了 G3BP2。此外，在未用索拉非尼刺激的 A549 细胞中，m-YSO4F-LSG 也能使蛋白免疫荧光染色信号与肽 FITC 信号共定位（图 5D），表明即使在无 SG 形成的条件下，液滴也能招募蛋白 G3BP2，招募蛋白可能是增强索拉非尼细胞毒性的次要途径。

Western blot 实验显示，经肽和索拉非尼处理的 A549 细胞中，m-YSO4F-LSG 处理的细胞磷酸化 p38（P-p38）和裂解的 caspase-3 水平显著增加（图 5F），证实了原位形成液滴增强了索拉非尼的 caspase 依赖性凋亡途径。尽管天然液滴 d-YF-LSG 和配体 FGDF-YSO4F 与索拉非尼共孵育也能提高活化 caspase-3 水平，但与 m-YSO4F-LSG 相比，其改善有限，表明原位相分离在抑制 SG 功能方面具有优势。CLSM 图像显示，在 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼处理的细胞中，RACK1 被液滴招募的情况显著减少（图 5G），与传统 SG 抑制剂 ISRIB 的结果一致。Western blot 分析还显示，索拉非尼处理的 A549 细胞中 MTK1 磷酸化被显著抑制，而添加 m-YSO4F-LSG 或 ISRIB 可增加 MTK1 磷酸化水平（图 5H），表明液滴 - SG 共醋液滴阻止了 RACK1 的隔离，并随后激活了 MTK1 磷酸化，从而抑制了 SG 功能（图 5I）。

图5 A, B) 经 m-YSO4F-LSG（A）或 YSO4F（B）处理 12 小时并用索拉非尼刺激 2 小时的 A549 细胞的免疫荧光染色 TIA-1 的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。C) 含有 NT-647 标记的蛋白 G3BP2 的液滴 d-YF-LSG 的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。D) 仅用 m-YSO4F-LSG 处理 12 小时的 A549 细胞的免疫荧光染色 G3BP2 的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。E, F) 经 PBS（1）、m-YSO4F-LSG（2）处理 24 小时，或经 Sor（3）处理 12 小时，以及经 d-YF-LSG（4）、FGDF-YSO4F（5）或 m-YSO4F-LSG（6）处理 12 小时后与索拉非尼共孵育 12 小时的 A549 细胞内 p38、P-p38、caspase-3 和裂解 caspase-3 水平的 Western blot 实验（E）和定量数据（F）。G) 预孵育 12 小时 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）并用索拉非尼（13 µm）额外孵育 2 小时的 A549 细胞的免疫荧光染色 G3BP2 和 RACK1 的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。H) 经 PBS、索拉非尼（13 µm）处理 2 小时，预孵育 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）12 小时或 ISRIB（200 nm）2 小时并用索拉非尼（13 µm）额外孵育 2 小时的 A549 细胞内 MTK1 和 P-MTK1 水平的 Western blot 实验。I) 原位形成液滴抑制 SG 功能并激活 caspase 依赖性凋亡途径的机制示意图。统计分析采用单因素方差（ANOVA）分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001

（6）原位LLPS系统的体内化疗效果及生物安全性研究

验证原位 LLPS 系统的无膜细胞器靶向功能后，开展动物实验研究原位形成液滴的体内化疗效果。用 A549 细胞皮下注射建立荷瘤 Balb/c 小鼠模型，肿瘤体积约 100 mm³ 时，小鼠随机分七组，每组接受四次给药，每隔一天一次。索拉非尼腹腔注射，肽瘤内注射，联合给药时交替日注射。治疗期间，每两天记录一次给药小鼠体重和肿瘤体积，21 天后解剖研究肿瘤组织。肿瘤生长曲线和重量显示，m-YSO4F-LSG 联合索拉非尼组肿瘤生长最慢（图 6A、B），表明原位形成液滴对索拉非尼化疗有增敏效果。解剖肿瘤组织大小也证实了联合注射抑制肿瘤生长（图 6C）。接着，通过解剖肿瘤组织切片的 CLSM 研究，探究肽的体内相分离和原位形成液滴的 SG 靶向行为。可能证实了肽的硫酸酯酶诱导体内相分离。此外，给药后 24 小时小鼠肿瘤组织切片显示，绿色肽 FITC 和红色 G3BP2 免疫荧光染色信号显著重叠，皮尔逊相关系数（PCC）约 0.77（图 6D）。而用 YSO4F 和索拉非尼注射的小鼠肿瘤组织内，肽和蛋白荧光信号几乎分离，PCC 值低（图 6），结果证明 m-YSO4F-LSG 成功靶向 SG。WB 实验评估肿瘤组织蛋白水平，确认增强化疗效果机制（图 6F），显示 m-YSO4F-LSG 和索拉非尼联合治疗组 P-p38 蛋白水平上调最明显（图 6G），伴随 caspase-3 水平下调和裂解 caspase-3 水平增加，表明原位形成液滴通过激活 caspase 依赖性凋亡途径增强治疗效果。对治疗小鼠肿瘤组织和主要器官进行苏木精 - 伊红（H&E）染色实验，确认肿瘤细胞凋亡并评估生物安全性（图 6H）。m-YSO4F-LSG + 索拉非尼治疗小鼠肿瘤组织内细胞萎缩和凋亡特征显著，支持治疗效果。

图6 A-C) 经 PBS、d-YF-LSG、m-YSO4F-LSG、索拉非尼（Sor）、YSO4F + 索拉非尼、d-YF-LSG + 索拉非尼和 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼处理的小鼠解剖的肿瘤组织的肿瘤生长曲线（A）、肿瘤重量（B）和代表性图像（C）。D, E) 经 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼（D）和 YSO4F + 索拉非尼（E）处理的小鼠肿瘤组织冰冻切片的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。F, G) 经 PBS（1）、m-YSO4F-LSG（2）、索拉非尼（3）、d-YF-LSG + 索拉非尼（4）和 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼（5）给药的小鼠肿瘤组织内 p38、P-p38、caspase-3 和裂解 caspase-3 蛋白水平的 Western blot 实验（F）或定量数据（G）。H) 经 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼给药后小鼠的肿瘤组织和主要器官的苏木精 - 伊红（H&E）染色图像。统计分析采用单因素方差（ANOVA）分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001