针对上述问题，温州医科大学肖健教授开发出一种具有分级递送性能的愈合阶段自适应调节水凝胶（F/R凝胶），用于慢性感染伤口的程序化调控，该凝胶通过阳离子多肽（ε-聚赖氨酸，εPL）与醛基化透明质酸（HA-CHO）之间的席夫碱交联反应快速制备而成，同时包载了εPL修饰的缺氧二氧化铈纳米酶（εPL-CeOv纳米酶）以及共负载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和c-Jun小干扰RNA（c-Jun siRNA）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微胶囊（F/R MCs），具备时序释放功能，这种水凝胶具有出色的粘附性和自愈合特性，能够适配不规则的伤口，有效抵抗细菌感染、促进血管生成、适时促进细胞外基质沉积，并抑制真皮纤维化。在感染小鼠伤口模型和兔耳增生性瘢痕伤口模型中，该设计均证实可实现伤口的快速愈合，同时显著减少瘢痕形成。该文章于2025年4月20日以《A dynamically phase-adaptive regulating hydrogel promotes ultrafast anti-fibrotic wound healing》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-58987-w）。

（1）F/R gel的构建与表征

阳离子抗菌剂ε-聚赖氨酸（εPL）通过席夫碱反应与醛基化透明质酸（HA-CHO）形成F/R凝胶网络，结晶态二氧化铈纳米酶（CeOv）和F/R微胶囊（F/R MCs）均匀嵌入其中（图1a）。采用W/O/W复乳液技术制备负载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和c-Jun小干扰RNA（c-Jun siRNA）的F/R MCs，扫描电子显微镜（SEM）显示其为粒径约6.23±2.70 μm的光滑微球（图1d），荧光标记法证实药物成功负载（图1e）。降解测试表明，微胶囊在生理溶液中缓慢分解，药物（bFGF和c-Jun siRNA）持续释放（图2k）。免疫荧光染色验证F/R MCs对成纤维细胞中c-Jun基因沉默效率，结果显示c-Jun基因表达显著降低（图1f）。

图1 F/R凝胶的设计及特性。（a）F/R凝胶的制备示意图，用于慢性感染伤口的程序性调控；（b）CeOv纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像；（c）CeOv纳米颗粒的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图像及晶格分析；（d）F/R微胶囊的扫描电子显微镜（SEM）图像；（e）F/R微胶囊的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像；（f）3T3细胞中c-Jun表达的荧光染色（绿色）

HA-CHO与εPL链（游离或εPL-CeOv）混合后，醛基与氨基迅速发生席夫碱反应，数秒内形成F/R凝胶（图2a）。凝胶具有多孔微观结构，铈元素均匀分布（图2b）。流变学测试显示，凝胶约3.0秒内形成稳定三维结构，杨氏模量约6.69 kPa。在0%-1000%剪切应变范围内，储能模量（G’）和损耗模量（G”）随剪切应力增加而降低，应变约770%时出现G”>G’拐点，表现出剪切稀化行为（图2d）。应变降至1%时，凝胶恢复弹性状态，且该过程可多次循环可逆，具有良好的可注射性和自愈合特性（图2e，f）。F/R凝胶在手指关节反复伸直或弯曲时仍能稳定粘附（图2g），且具有良好的拉伸性能（图2h-j）。在弱酸性微环境下，凝胶解离，低分子εPL或超小εPL-CeOv释放发挥抗菌和免疫调节功能。由于PLGA微胶囊尺寸较大且降解缓慢，F/R MCs分解延迟，bFGF/siRNA随后释放促进组织再生。药物释放曲线显示，中性PBS中孵育时，εPL-CeOv第6天释放约91.13%；bFGF和siRNA随凝胶降解逐渐释放，第7天bFGF累积释放量接近85%，siRNA达约74.48%。酸性微环境（pH=4.5）加速药物释放，尤其是εPL-CeOv，符合席夫碱键的酸敏感性（图2k）。该凝胶系统具备分级药物递送特性：先释放抗菌εPL成分，随后CeOv纳米酶清除ROS、调节炎症，最后bFGF和siRNA促进血管新生、细胞增殖并调节成纤维细胞亚型，为按需精准给药提供可能，具有快速抗纤维化伤口愈合的潜力（图2l）。

图2 F/R凝胶的表征。（a）凝胶制备的示意图；（b）F/R凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图像及元素分布；（c）F/R凝胶的时间扫描流变曲线；（d）应变扫描下的储能模量（G'）与损耗模量（G''）；（e）交替施加1%与800%应变时F/R凝胶的流变变化；（f）凝胶自愈合过程的代表性照片；（g）凝胶粘附性能的代表性照片；（h）凝胶可拉伸性能的代表性照片；（i）凝胶黏附性能的代表性图片；（j）猪皮张力拉伸测试；（k）F/R凝胶组分在中性PBS（pH = 7.4）和酸性PBS（pH = 4.5）中的体外释放特性；（l）F/R凝胶在无瘢痕伤口愈合过程中动态相适应调控功能的示意图

（2）抗菌和抗生物膜性能

F/R凝胶对耐药菌感染伤口具有显著的抗菌效果。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为模型菌株，F/R凝胶处理后菌落数量显著减少，与环丙沙星相当（图3a，b）。F/R凝胶对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长均有抑制作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制率约89%，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌清除率接近95%（图3a，b）。细菌死活染色证实凝胶能迅速杀死细菌（图3a，b），扫描电子显微镜图像显示细菌形态发生破坏性变化（图3c）。F/R凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制率分别为95.08%、87.10%和87.89%，显著高于环丙沙星（图3d）。同时，该凝胶对成熟生物膜的破坏率分别为82.53%、81.38%和71.35%（图3e），细菌死活染色进一步验证其强大的生物膜清除能力（图3e）。综合分析生物膜厚度、生物量、粗糙度和绿色荧光强度等参数后，F/R凝胶比环丙沙星具有更强的生物膜破坏能力（图3f，g）。F/R凝胶和空白凝胶的生物膜破坏效率无显著差异，表明水凝胶基质成分（εPL和εPL-CeOv）在解离生物膜方面起关键作用，F/R微胶囊的添加未削弱其抗菌活性。

图3 F/R凝胶的体外抗菌和抗生物膜活性。（a）不同处理后细菌菌落及细菌死活染色的代表性图像；（b）菌落计数和死活细菌的统计分析；（c）F/R凝胶处理前后细菌的扫描电子显微镜（SEM）图像；（d）F/R凝胶对生物膜破坏效果的实验示意图；（e）各种处理后成熟生物膜的结晶紫染色和细菌死活染色图像；（f）成熟生物膜的生物膜评估值；（g）从e中的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）平面量化得到的绿色荧光强度与生物膜深度的关系

（3）抗氧化和抗炎性能评估

εPL-CeOv是清除活性氧（ROS）的主要成分，通过Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化态之间的快速氧化还原循环接受或转移电子（图4a）。空白凝胶和F/R凝胶的ROS清除效率与纯εPL-CeOv几乎相同，而F/R微胶囊的清除活性很低（图4b-f），表明εPL-CeOv与HA-CHO交联不影响其活性，且纳米酶在凝胶基质中的均匀分布确保了强大的抗氧化能力。密度泛函理论（DFT）计算表明，超小CeOv表面富含氧空位，存在催化活性的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原电对（图4g）。电荷密度图显示氧空位导致电子重新分布，相邻Ce原子被还原，Ce的价态降低约0.47个电子（图4h）。CeOv对ABTS⁺·、DPPH·、H₂O₂、·OH和·O₂⁻的结合能分别为-3.87 eV、-3.97 eV、-4.83 eV、-6.46 eV和-7.46 eV（图4i），显著高于CeO₂，增强了对自由基的催化活性。图4j展示了CeOv模拟超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性的反应路径。·O₂⁻自由基与CeOv表面结合，通过与氧空位中的Ce³⁺相互作用，吉布斯自由能（ΔG）为-2.36 eV，电子从Ce³⁺转移到氧原子上，生成H₂O₂，模拟SOD活性。对于CAT模拟过程，H₂O₂吸附导致Ce⁴⁺→Ce³⁺的价态转变，生成质子和氧分子。Ce³⁺与另一个H₂O₂分子反应，转移质子生成H₂O，Ce³⁺重新氧化为Ce⁴⁺，完成催化循环。

图4 体外抗氧化活性和DFT计算。（a）F/R凝胶的ROS清除能力示意图；（b）F/R凝胶对ABTS自由基的清除实验；（c）F/R凝胶对DPPH自由基的清除实验；（d）F/R凝胶对过氧化氢的清除实验；（e）F/R凝胶对羟基自由基的清除实验；（f）F/R凝胶对超氧阴离子的清除实验；（g）氧空位型CeOv纳米酶的粒子模型及其单元格构型；（h）CeO₂（上图）和CeOv（下图）的模拟电子密度图像；（i）CeOv（111）晶面上吸附的ABTS⁺·、DPPH·、H₂O₂、·OH和·O₂⁻自由基的优化结构俯视图及相应的结合能（Ebinding）值；（j）CeOv（111）晶面上模拟的超氧化物歧化酶（SOD-like）和过氧化氢酶（CAT-like）催化过程的反应能谱图

（4）ROS清除与生物相容性评估

F/R凝胶能够中断炎症性ROS循环，清除细胞内过量ROS并抑制巨噬细胞向促炎性M1型极化。在3T3和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的氧化应激模型中，F/R凝胶显著降低了细胞内ROS强度，3T3细胞降低6倍以上，HUVEC细胞降低2倍（图5b，c）。荧光图像显示，F/R凝胶处理后3T3和HUVEC细胞中ROS水平显著降低（图5d，e），且羟苯基荧光素（HPF）染色结果表明细胞活力显著恢复（图5d，e）。在脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞M1型极化模型中，F/R凝胶显著降低CD86阳性率，仅约为2.56%，与LPS组相比降低了近6.7倍（图5f，g）。其机制包括bFGF抑制NF-κB信号通路激活，以及εPL-CeOv清除细胞内ROS。

F/R凝胶具有良好的生物相容性。血液相容性测试显示，F/R凝胶组溶血率接近0%，与阴性组相当（图5h，i）。体内生物相容性测试中，将F/R凝胶皮下移植到小鼠皮肤，30天后H&E染色结果显示小鼠皮肤和主要器官中无明显炎症反应或组织异常（图5k），且所有血常规和生化指标均在正常范围内（图5l）。

图5 F/R凝胶的细胞内氧化应激消除、巨噬细胞极化效应及生物相容性评估。（a）细胞实验示意图；（b）3T3和HUVEC细胞上DCFH-DA荧光的流式细胞术分析；（c）细胞内DCFH-DA荧光强度的统计数据；（d）3T3细胞上DCFH-DA探针（绿色）、HPF探针（绿色）和活/死细胞染色实验（Calcein，绿色，PI，红色）的荧光图像；（e）相应的统计分析；（f）巨噬细胞上CD86标记的流式细胞术分析；（g）相应的统计数据；（h）红细胞显微图像；（i）各种处理下的红细胞溶血率；（j）皮下植入测试示意图；（k）F/R凝胶植入28天后的皮肤组织H&E染色图像；（l）血液常规及生化指标

（5）F/R凝胶促进小鼠感染MRSA的慢性伤口快速愈合

在C57BL/6小鼠背部制造感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的全层切除伤口模型，分别用PBS、贝复济凝胶、F/R微胶囊、空白凝胶和F/R凝胶处理。F/R凝胶组伤口闭合速度最快，第4天未愈合伤口面积降至约63.25%，第7天降至约32.56%，第14天几乎完全愈合，愈合时间缩短约6-7天（图6a-c）。F/R凝胶组伤口渗出液中细菌菌落数最低，第7天几乎无菌（图6d，e）。第4天，F/R凝胶组伤口中ROS和CD86荧光信号微弱，而M2型巨噬细胞（CD206）染色信号较强，表明炎症减轻（图6f）。第7天，F/R凝胶组炎症不明显，新生血管标志物CD31和VEGF表达更高，Ki67表达最高，表明细胞增殖活跃（图6f，g）。第14天，F/R凝胶组再生皮肤中出现新形成的毛囊和皮脂腺，胶原沉积更成熟且排列有序（图6f）。

图6 F/R凝胶对小鼠MRSA感染慢性伤口的体内快速愈合效果。（a）小鼠全动物实验的实验过程示意图；（b）从第0天到第14天的伤口愈合变化的光学照片和模拟图；（c）14天内伤口面积的变化曲线；（d）2-7天间使用伤口渗出液进行菌落计数实验与（e）代表性图像；（f）在伤口愈合过程中对DHE（红色）、CD86（绿色）、CD206（红色）、CD31（红色）、VEGF（红色）、Ki67（绿色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色图像；（g）CD86、iNOS、IL-1β、TNF-α、CD206、Arg1、IL-10和Ki67的相对mRNA表达

（6）F/R凝胶可抑制小鼠受MRSA感染的慢性伤口瘢痕的形成

对再生皮肤进行外观检查和组织病理学评估，重点关注瘢痕面积、色素沉着、表皮厚度、胶原比例及皮肤附属器等参数。F/R凝胶组新生皮肤弹性更好，色素沉着更少，表皮颜色更均匀，组织凹陷更少。第28天，F/R凝胶组新生表皮颜色与周围组织无明显色差，而其他组变化不大（图7a）。F/R凝胶组第21天瘢痕面积仅约17.51%，第28天接近0%，而对照组瘢痕面积从第21天的约59.88%升至第28天的约64.28%（图7b）。F/R凝胶组表皮厚度接近正常皮肤（约20.54 μm vs.约20.57 μm），而对照组表皮厚度增加6倍（图7c）。F/R凝胶组观察到成熟的皮肤附属器，数量与正常组织相当，免疫荧光染色证实毛囊形成（图7c，d）。此外，F/R凝胶组再生组织中观察到神经束（β3-Tublin阳性）再生（图7d）。

马松三色染色显示，F/R凝胶组胶原沉积更成熟、排列更有序，胶原体积分数值（CFV）更低（约23.90%），接近正常皮肤（约20%），而对照组为78.83%（图7d，e）。F/R凝胶组I型胶原表达降低，III型胶原表达增加，表明其防止纤维化瘢痕形成的能力（图7d-f）。c-Jun表达显著缓解，TGF-β表达下降，而F/R MCs组中c-Jun表达未受影响，可能由于其在愈合过程中快速流失，突显了凝胶系统协同促进无瘢痕愈合的必要性。

图7 F/R凝胶减轻小鼠MRSA感染慢性伤口的纤维化疤痕形成。（a）从第21天到第28天的瘢痕区域变化的光学照片和模拟图；（b）处理后瘢痕组织的变化曲线和颜色分析（L值越高表示颜色越白，A值越高表示颜色越红）；（c）通过H&E染色分析的表皮厚度和毛囊计数；（d）第21天到第28天伤口组织的H&E染色、Masson染色以及COL I（红色）、COL III（绿色）、TGF-β（红色）、c-Jun（红色）、CK19（绿色）、β3-Tublin（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色图像；（e）基于组织切片分析的胶原体积比、分形维度值和空隙度值；（f）第28天COL I、COL III和c-Jun的相对mRNA表达

（7）荧光激活细胞分选（FACS）和转录组测序分析

研究假设通过递送碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和c-Jun小干扰RNA（c-Jun siRNA），可调节成纤维细胞亚型，实现抗纤维化伤口愈合。第7天流式细胞术（FACS）实验显示，F/R凝胶组中网状成纤维细胞比例显著低于对照组，而脂肪成纤维细胞比例增加（图8a，b）。F/R凝胶组中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平适度且稳定，而其他组α-SMA表达持续升高，表明其存在纤维化风险（图8d，e）。干细胞抗原-1（Sca-1）在F/R凝胶组中表达水平较高（图8d，e）。第14天的转录组分析显示，F/R凝胶组中有318个差异表达基因，其中175个上调，143个下调（图8g）。Eln基因（编码弹性蛋白）在F/R凝胶组中显著上调（图8h），与血管再生（Myl7）、肌肉再生（Myog）、毛囊发育和附属器再生（Sp6、Gsdma3、Elf5）相关的基因也显著上调，而与纤维化瘢痕形成相关的基因（如Ugt8a、Il-11、Gcgr、Tgfbr3l）表达下调。c-Jun表达在F/R凝胶组中受到抑制。KEGG通路富集分析显示，代谢通路显著富集，涉及IL-17、NF-κB、JAK-STAT、HIF-1和TGF-β通路（图8i）。GO分析表明，差异表达基因主要参与细胞对TGF-β刺激的反应等生物学过程（图8j）。

图8 通过FACS和转录组测序测量分析细胞分子水平的潜在调控机制。（a）FACS实验对伤口组织的过程示意图；（b）伤口组织中成纤维细胞亚型的流式细胞术结果；（c）通过c-Jun沉默策略调控的成纤维细胞亚型示意图；（d）第7天、14天和28天伤口组织中的α-SMA（绿色）和Sca-1（红色）标记物的免疫荧光染色图像；（e）α-SMA和Sca-1信号的平均荧光强度；（f）测试样本的Pearson相关系数矩阵热图；（g）F/R凝胶组与对照组在第14天的火山图分析；（h）参与愈合过程的筛选差异表达基因的热图；（i）差异表达基因的KEGG富集分析；（j）GO富集分析

（8）F/R凝胶促进兔耳伤口无瘢痕愈合

在兔耳伤口模型中评估了F/R凝胶的抗瘢痕愈合效果。通过切除直径8 mm的全层皮肤并感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）构建兔耳增生性伤口模型（图9a）。F/R凝胶显著提高了伤口愈合效率，第7天伤口开始加速闭合，第14天愈合效率达约87.66%（图9c）。对照组在第21天伤口闭合后出现严重红色增生性瘢痕，第28天仍未消退，瘢痕面积约为28.3 mm²，占初始伤口面积的56.33%。而F/R凝胶组再生组织逐渐恢复至与周围正常皮肤一致，表皮平整，颜色均一，弹性相似。

超声成像、H&E染色和马松三色染色结果显示，F/R凝胶组组织更平整，厚度接近正常皮肤，表皮厚度与正常组织相近（图9d-f）。F/R凝胶组的瘢痕评估指数（SEI）、瘢痕厚度和瘢痕隆起角度值最小（图9e），瘢痕色素沉着评分较低。马松染色显示，F/R凝胶组胶原纤维沉积减少，排列有序，与正常皮肤相当，而其他组胶原纤维呈漩涡状结构（图9f）。胶原纤维取向分布显示，F/R凝胶组胶原排列与正常皮肤相似（图9g）。这些结果表明，F/R凝胶在兔耳感染伤口模型中可有效加速伤口闭合并减轻纤维化瘢痕形成。

图9 F/R凝胶对兔耳增生伤口的无瘢痕愈合效果。（a）兔耳伤口模型和随后的动物实验示意图；（b）从第0天到第28天伤口愈合变化的光学照片、模拟图及（c）统计数据；（d）评估与兔耳瘢痕形成相关的指标示意图；（e）SEI、瘢痕厚度、瘢痕凸起角度和颜色测量的统计数据；（f）超声成像（红色虚线表示增生性瘢痕区）、H&E染色和Masson染色图像；（g）基于f图中的Masson染色图像分析的胶原纤维方向分布