针对上述问题，南京师范大学万密密、毛春等人设计了一种口服人工线粒体纳米机器人（AMNs），用于修复受损细胞的能量供应系统，直接提供ATP。该纳米平台由两性离子单体MAPCr（含运动和能量产生单元）和PFA（屏障穿越单元）制备而成。在IHD模型中，AMNs的PCr部分可与细胞质中的ADP反应生成ATP，修复能量供应系统。其PFA部分可穿透肠黏液屏障进入血流，L-精氨酸部分则靶向受损线粒体。到达受损心脏后，AMNs能快速产生ATP，减轻线粒体负担，恢复细胞活性，同时与ROS反应生成NO，减轻炎症并促进线粒体活性。该文章于2025年4月14日以《Artificial Mitochondrial Nanorobots Deliver Energy In Vivo by Oral Administration》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202500495）。

（1）PFMACr AMNs 的制备和表征

选择两性离子N-甲基丙烯酰基-L-精氨酸-磷酸肌酸（MAPCr）和丙烯酸十五烷基氯辛酯（PFA）作为单体制备PFMACr AMN（图1A）。在IHD模型中，AMNs的PCr部分可与细胞质中的ADP反应生成ATP，修复PCr-CK供能系统（图1B）。口服后，PFMACr AMN的PFA部分可穿透肠黏液屏障进入血流（图1C）。TEM结果显示纳米颗粒呈均匀球形（图1D），DLS测量其流体动力学直径约为150 nm（图1E），添加PFA的样品ζ电位降低（图1F）。共聚焦图像和DLS结果表明PFMACr AMN表面无蛋白质粘附（图1G，H）。处理后，损伤心肌细胞中ROS水平恢复正常，NO水平增加至正常心肌细胞的2.8倍（图1I-K），这可能是由于MAPCr组分消耗ROS并产生NO。PFMACr AMNs在10 mM GSH的模拟生理环境中12小时内迅速降解后保持稳定（图1L），表明其可在细胞环境中降解并暴露活性位点。与仅维持3小时ATP合成能力的纯PCr相比，PFMACr AMN可使受损心肌细胞内ATP水平持续增加至少12小时（图1M）。400 μg AMNs在10⁵受损心肌细胞中的ATP生产能力与10⁷天然线粒体相当（图1N）。

图1 PFMACrAMN的制备、口服给药及基本性质。（a）PFMACrAMN的制备方法；（b）PFMACrAMNs产生NO促进受损线粒体生物合成，并提供PCr促进ATP产生；（c）PFMACrAMN口服给药的体内递送及治疗途径；（d）不同样品的TEM图像（比例尺：200 nm）；（e，f）分散在PBS中的样品的水合粒度和电位（I：PML，II：PFML，III：PFMA，IV：PMACr，V：PFMACr）；（g）Cy5标记的PFMACrAMN（红色）和FITC标记的BSA（绿色）混合溶液在37℃孵育4 h后的荧光图像（比例尺：10 µm）；（h）37℃孵育4 h后PFMACrAMN（1 mg/mL）和BSA（500 mg/mL）的DLS结果；（i，j）PFMACrAMN处理的缺氧损伤H9c2细胞中ROS（i）和NO（j）水平的CLSM图像（比例尺：50 µm）；（k）i和j的归一化荧光强度；（l）PFMACrAMNs在PBS或10 mM GSH中降解48 h的相对浊度；（m）PFMACrAMN在缺氧损伤H9c2细胞中产生ATP的能力；（n）PFMACrAMN与天然线粒体在缺氧损伤H9c2细胞中产生ATP能力的比较（n=3-4）

（2）趋化运动行为

PFMACr AMNs中的L-Arg组分能够响应损伤心肌细胞中高表达的iNOS，诱导其在损伤细胞中的趋化运动。在静态Y形微流体通道模型中，正常H9c2细胞环境中，PFML NPs和PFMACr AMNs呈典型布朗运动；而在LPS预刺激损伤的H9c2细胞中，PFML NPs仍保持布朗运动轨迹（速度小于1 µm/s），PFMACr AMNs的运动速度则显著提高至5.2 µm/s（图2A、B）。在静态模型中，将含有正常和预刺激H9c2细胞裂解物的琼脂糖凝胶填充到通道中，PFML NPs在室II和室III的荧光强度无显著差异（图2C、D、E），而PFMACr AMNs在室III的荧光强度显著高于室II，且60分钟时差异最大，室III荧光强度是室II的6.7倍（图2F、G），表明PFMACr AMNs能够感知高浓度iNOS并沿其浓度梯度扩散。在动态“Y”型微流体模型中，当两侧通道均填充正常H9c2细胞裂解物时，PFML NPs和PFMACr AMNs均未表现出趋化行为（图2H、I、J）；而当一侧通道填充预刺激H9c2细胞裂解物时，PFMACr AMNs的红色荧光向预刺激侧移动，移动距离为1095.3 µm，而PFML NPs未表现出趋化行为（图2K、L）。

图2 PFMACr AMNs在模拟IHD微环境中的运动行为。（a，b）PFML NP（a）和PFMACr AMN（b）在预刺激H9c2细胞中的轨迹和速度分布（20 s，n=10）；（c）静态Y形通道示意图；（d，e）PFML NP添加后不同时间室II和室III的荧光图像（60分钟）（d）及归一化荧光强度（e）（比例尺：500 µm）；（f，g）PFMACr AMNs添加后不同时间室II和室IV的荧光图像（60分钟）（f）及归一化荧光强度（g）（比例尺：500 µm）；（h）动态微流控装置示意图；（i，j）在两个通道中应用正常H9c2细胞裂解物的微流体装置中PFML NP和PFMACr AMN的代表性荧光图像（i）及标准化荧光强度（j）（比例尺：500 µm）；（k，l）施加正常H9c2细胞裂解物和预刺激H9c2细胞裂解物的微流体装置中PFML NP和PFMACr AMN的代表性荧光图像（k）及归一化荧光强度（l）（比例尺：500 µm）

（3）损伤细胞对PFMACr AMNs的细胞摄取行为

PFMACr AMNs能够有效穿透血管内皮细胞屏障并被受损心肌细胞摄取。在2D Transwell模型中，PMACr NM的穿透能力优于PML NP，而PFMACr AMNs的穿透能力最强（图3A-C）。在缺氧损伤的H9c2细胞中，PFMACr AMNs的摄取表现为更突出的红色荧光信号（图3D，E）。摄取抑制剂实验表明，PFMACr AMNs进入心肌细胞主要通过小窝蛋白介导的途径和能量依赖的内吞途径。细胞器定位实验显示，PFMACr AMNs聚集在线粒体附近，可能是因为线粒体损伤时释放大量ROS，而PFMACr AMNs倾向于聚集在ROS浓度高的区域以转化为NO。此外，其修饰有助于通过疏水相互作用与膜脂质融合，并通过疏脂性诱导快速跨膜扩散，增强溶酶体逃逸功能（图3F，G）。

（4）体外治疗效果

PFMACr AMNs的MAPCr可与H₂O₂反应产生NO。缺氧损伤的H9c2细胞中H₂O₂含量是正常细胞的2.3倍（图3H）。PFML NPs处理后H₂O₂未减少，而非氟PMACr NMs和PFMACr AMNs能消耗缺氧细胞中的H₂O₂，使O₂⁻和MDA降至空白组水平（图3I）。氧化应激缓解后，损伤相关分子模式释放减少，促炎基因表达和炎性细胞因子分泌被抑制，TNF-α和IL-6水平回到空白组水平（图3J）。PFMACr AMNs通过NO降低细胞质Ca²⁺水平，缓解线粒体钙超载，经Fluo-4 AM标记后，缺氧细胞经PFMACr AMNs处理的Ca²⁺水平恢复正常（图3K，L）。JC-1标记显示，PMACr NM和PFMACr AMN处理可使线粒体膜电位恢复（图3M，N）。NO还可上调PGC-1α水平，刺激线粒体生物合成（图3O）。PFMACr AMNs参与PCr-CK能量穿梭快速合成ATP，与缺氧损伤的H9c2细胞共孵育后，ATP合成可持续12小时，使缺氧损伤细胞中ATP水平与正常细胞相当（5.6和5.2 µm）（图3P）。此外，PFMACr AMNs还能恢复细胞活力，48小时内可将缺氧损伤的H9c2细胞活性维持在91%（图3Q）。

图3 PFMACr AMNs的细胞摄取、选择性胞吐和体外治疗作用。（a）模拟体外HUVEC的PFMACr AMNs渗透Transwell的示意图；（b，c）缺氧损伤的H9c2细胞（Transwell下室）的CLSM图像（b）和归一化荧光强度（c）（比例尺：50 µm）；（d，e）缺氧损伤的H9c2细胞中不同样品的摄取CLSM图像（d）和归一化荧光强度（e）（比例尺：50 µm）；（f，g）缺氧损伤的H9c2细胞线粒体中PML NP（f）和PFMACr AMN（g）的CLSM图像及共定位结果（比例尺：50 µm）；（h-j）不同样品处理后缺氧损伤的H9c2细胞中H₂O₂（h）、O₂⁻和MDA（i）以及炎症水平（j）；（k，l）不同样品处理后缺氧损伤的H9c2细胞中Ca²⁺水平和线粒体状态的归一化定量结果（k）及CLSM图像（l）（比例尺：50 µm）；（m，n）不同样品处理后缺氧损伤的H9c2细胞线粒体状态的CLSM图像（m）和标准化定量结果（n）（比例尺：50 µm）；（o）PFMACr MNs处理后缺氧损伤的H9c2细胞中PGC-1α浓度结果；（p）PFMACr AMNs处理后缺氧损伤的H9c2细胞中ATP水平变化；（q）PFMACr AMNs处理后缺氧损伤的H9c2细胞活性

（5）评价 PFMACr AMNs 在体外和体内突破多重屏障并靶向受损心脏的能力

PFMACr AMNs在胃肠道环境中保持稳定，其粒径在pH 1.2和pH 6.8条件下24小时内不变（图4A、B）。酸碱处理后的PFMACr AMNs与缺氧损伤的H9c2细胞共培养，仍能显著提升细胞ATP水平（图4C），并将NO水平恢复至正常（图4D）。其PFA组分可防止粘蛋白吸附，使其在小鼠肠黏液中的扩散位移和速度高于PMACr NP。Transwell和离体小肠组织实验证明PFMACr AMNs能非破坏性地穿透肠屏障。离体器官成像显示，口服PFMACr AMNs后，其在大鼠肠组织中的荧光强度0.5小时达高峰，3小时内肠系膜微血管荧光强度是PML NPs处理的2.6倍（图4E-I）。

在小鼠皮下肿瘤模型中，PFMACr AMNs静脉注射后10分钟即可突破血管内皮屏障，出现在病变组织中（图4J、K）。在正常小鼠心脏中，PFMACr AMNs主要停留在血管内，而在受伤心脏模型中，其可在口服给药12小时后积聚于心脏组织。与健康大鼠口服PFMACr AMNs（I组）、IHD大鼠口服PML NPs（II组）相比，IHD大鼠静脉注射（III组）和口服（IV组）PFMACr AMNs后，在受损心脏中荧光信号更强（图4N）。口服给药的PFMACr AMNs在IHD损伤心脏中的靶向效率是静脉内给药的16.3%，而静脉内给药的靶向效率是口服给药的135%（图4O，P）。在健康心脏近端区域，III组和IV组PFMACr AMNs的荧光强度分别是I组的3.9倍和2.0倍；在iNOS富集的心脏中部和远端区域，III组PFMACr AMNs的荧光累积分别是I组健康心脏远端区域的10.6倍和8.8倍。研究表明，AMNs在心脏损伤部位的蓄积量大于健康部位，且IV组口服PFMACr AMNs显著增强了其浸润损伤心脏的能力（图4Q，R）。

图4 PFMACr AMN的稳定性及其跨越多种生理屏障靶向缺血心脏的能力的表征。（a，b）PFMACr AMNs在pH 1.2（胃pH）（a）和pH 6.8（肠pH）（b）环境中的DLS监测结果；（c，d）经酸（2小时）-碱（6小时）处理的PFMACr AMNs在缺氧损伤的H9c2细胞中产生ATP（c）和NO（d）的能力，对照为未处理的PFMACr AMNs（I：空白，II：模型，III：未处理的PFMACr AMN，IV：处理的PFMACr AMN）；（e）样品穿过肠屏障的观察点示意图；（f，g）口服施用不同cy5标记样品2小时后大鼠肠组织的离体图像（f）和定量结果（g）；（h，i）口服施用不同cy5标记样品3小时后大鼠肠系膜微血管系统的图像（h）和归一化荧光强度（i）（比例尺：100 µm）；（j，k）健康C57BL/6小鼠口服施用PML NP（j）和PFMACr AMN（k）2小时后，基于共聚焦技术的体内显微镜捕获的小肠部位连续图像（比例尺：100 µm）；（l，m）健康C57BL/6小鼠静脉内注射PFMACr AMNs（l）后10分钟和心脏损伤C57BL/6小鼠口服施用PFMACr AMNs（m）后12小时，基于共聚焦技术的体内显微镜捕获的从血管释放到心脏组织中的PFMACr AMNs的连续图像（比例尺：100 µm）；（n-p）大鼠口服或静脉内施用12小时后心脏（n）和向心脏（o）及其他主要器官（p）的递送效率的离体图像；（q，r）大鼠经口或静脉给药12小时后cy5标记样品在心脏梗死区分布的免疫荧光图像（q）和相应的归一化荧光强度（r）（比例尺：200 µm）

（6）体内治疗效果

在心肌梗死（MI）模型中研究PFMACr AMNs的治疗效果（图5A）。第7天，静脉内施用的PFMACr AMNs（EF：87.7%）比口服的（EF：78.9%）更好地恢复心脏功能（图5B-F），与靶向效率差异一致（图4O）。增加口服给药频率（第VII组）后，IHD大鼠心脏功能持续改善，第7天EF达79.7%，但仍低于静脉给药组。静脉注射组心脏功能在给药周期结束后逐渐恶化，而持续口服组在整个28天期间保持稳定，表明增加口服频率可阻止心脏功能恶化。PFMACr AMNs的疗效优于临床药物BB（III组），可能因其直接合成ATP，优化缺血心肌的能量代谢。给药28天后，通过TTC染色观察各组大鼠心脏损伤面积（图5G），结果显示，与对照组（38.8%）相比，PFMACr AMNs口服7天组（V组）、静脉注射7天组（VI组）和口服28天组（VII组）均有效缩小梗死面积，左心室AOI比例分别降至14.9%、8.7%和10.5%（图5H）。Masson染色（图5I、J）显示，V组、VI组和VII组纤维化程度显著低于对照组和BB组。免疫组织化学CD31染色（图5K、L）显示，PFMACr AMNs治疗显著增加CD31阳性细胞数量（V组：11.8%，VI组：16.6%，VII组：15.9%），改善缺氧损伤区域血供。长期口服PFMACr AMNs能有效预防疾病进展，但前7天治疗效果低于静脉给药组（EF：87.7%）。为验证是否与累积量差异有关，增加单次口服剂量（从10 mg/kg增至50 mg/kg），心脏靶向效率从6.3%变化至5.0%，绝对累积量从126 µg/g增加至500 µg/g（图5M、N）。增加剂量后，第7天IHD大鼠心脏功能恢复（EF：85.9%）接近静脉注射组，并在第28天保持稳定，接近健康大鼠功能（图5O、P）。

图5 PFMACr AMNs对缺血性心脏病大鼠的治疗作用。（a）IHD大鼠治疗方案示意图，未治疗的IHD大鼠作为对照组；（b）治疗后IHD大鼠的M型超声心动图；（c，d）治疗期间IHD大鼠的EF（c）和FS（d）曲线；（e，f）治疗后IHD大鼠中EF（e）和FS（f）的定量结果；（g，h）梗塞区域以虚线圈出的代表性图像（g）及IHD大鼠TTC染色心脏切片中LV的AOI定量（h）；（i，j）纤维化区域以虚线圈出的代表性图像（i）及IHD大鼠Masson染色心脏切片中LV纤维化区域的定量（j）；（k，l）IHD大鼠CD31免疫染色心脏切片的血管密度（k）和CLSM图像（l）的定量（比例尺：100 µm）；（m，n）大鼠口服或静脉内施用12小时后向心脏（m）和其他主要器官（n）的递送效率；（o，p）PFMACr AMNs治疗7天后大鼠EF（o）和FS（p）的定量结果（前7天每天两次，第8-14天每天一次，第15-28天每周两次）；（I：假手术大鼠；II：未处理的IHD大鼠；III：IHD大鼠静脉内给予PFMACr AMN，每次10 mg/kg bw；IV：IHD大鼠口服给予PFMACr AMN，每次10 mg/kg bw；V：IHD大鼠口服给予PFMACr AMN，每次50 mg/kg bw）

（7）治疗后心脏组织的心脏多组学分析

对自然线粒体组（Mito组）和AMNs治疗组（PFMACr组）的大鼠心脏进行转录组分析。基于GO和KEGG富集分析（图6A），天然线粒体移植显著上调与线粒体代谢和结构功能相关的基因，包括线粒体膜、基质、内膜、脂肪酸β-氧化、TCA循环和NADH代谢过程。AMNs治疗组的基因测序结果也显示类似上调基因（图6B），表明AMNs可在基因水平上发挥与天然线粒体类似的功能。同时，下调基因分析显示，天然线粒体处理后，与细胞凋亡、伤口愈合和缺氧反应相关的基因显著下调（图6C），表明心肌细胞活力和适应性增加；AMNs处理后，与炎症、凋亡和纤维化相关的基因也显著下调（图6D），表明AMNs修复了心脏功能。天然和AMNs治疗后心脏受损区域的基因分析显示，两者之间仅有262个DEG，且PFMACr对炎症和免疫相关通路表现出调节作用（图6E、F），包括上调白细胞介素-27信号通路和下调免疫球蛋白介导的免疫应答。基因集富集分析（GSEA）表明，与对照组相比，Mito组和PFMACr组中与氧化磷酸化和TCA循环相关的基因表达上调，而与细胞纤维化相关的基因表达被抑制（图6G）。

图6 天然线粒体和PFMACr AMN处理的IHD大鼠的心脏转录组学。（a-f）GO和KEGG富集分析显示，与对照组相比，天然线粒体（Mito）组（a，b）和PFMACr组（c，d）中差异表达的基因，以及与Mito组相比，PFMACr组中差异表达的基因（e，f）。弦图：右侧反映分类组成，中间线表示分类和基因对应关系，左边圆圈为GO术语中的DEG；气泡图：气泡大小表示差异表达基因数量；直方图：GO条目名称显示在左侧。（g）应用GSEA比较Mito组和对照组之间以及PFMACr组和对照组之间参与氧化磷酸化、TCA循环和凋亡途径的基因组