针对上述问题，浙江大学周民教授团队开发了一种基于Rhein的超分子网络水凝胶（Rh Gel），并将其与微藻衍生的细胞外囊泡（SP-EVs）结合，形成Rh Gel@SP-EVs复合物，以期提高治疗效果。通过一系列体外实验验证了该复合物对TNF-α诱导的氧化损伤具有显著保护作用，并通过动物模型评估了其在治疗DMM（前交叉韧带切断术）诱导的OA中的疗效。结果表明，Rh Gel@SP-EVs不仅能有效缓解炎症反应、促进能量稳态，还能增加关节软骨厚度、改善OARSI评分，显示出维持关节软骨完整性的潜力。此外，安全性评估也证实了该复合物的良好生物相容性，为未来临床应用奠定了基础。该文章于2025年2月21日以《Microalgae-Derived Extracellular Vesicles Synergize with Herbal Hydrogel for Energy Homeostasis in Osteoarthritis Treatment》为题发表于《ACS Nano》（DOI: 10.1021/acsnano.4c16085）。

研究示意图

（1）SP-EV的分离、表征、和分析

图1a描绘了SP-EVs的提取流程，通过梯度离心和连续过滤实现了有效纯化；透射电子显微镜（TEM）图像（图1b）显示了典型的50至100 nm盘状囊泡结构，证实了其形态特征（标尺=50 nm）。粒径分布和Zeta电位分析（图1c-d）表明SP-EVs的尺寸集中在50-100纳米范围内，Zeta电位约为-13 mV，进一步验证了分离的有效性。蛋白质组学分析（图1e）揭示了SP-EVs中含有62种蛋白质，基因本体论（GO）分类（图1f-g）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析（图1h）显示这些蛋白质主要参与ATP依赖的活动和代谢过程，强调了它们在能量代谢中的关键作用。此外，正交群组蛋白注释（图 S2）突出了翻译、能量生产和转换相关蛋白质的重要性，表明SP-EVs在调节关节稳态及骨关节炎（OA）病理生理方面具有潜在的应用价值。这些结果综合说明了SP-EVs作为一种治疗OA的新策略的可能性，特别是在调节能量代谢方面的作用。

图1. SP-EV的提取、表征和分析。（a）SP-EV的浸提过程；（b）SP-EV的透射电子显微镜（TEM）图像，比例尺 = 50 nm；（c）SP-EV的粒度；（d）SP-EV的Zeta电位（n = 3）；（e）通过蛋白质组学分析表征SP-EV中的蛋白质组分；（f）SP-EV中蛋白质的分子功能（MF）；（g）与SP-EV中蛋白质相关的生物学过程（BP）；（h）SP-EV的京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

（2）Rh Gel@SP-EVs的合成与表征

首先，图2a提供了Rh Gel@SP-EVs的合成流程示意图，通过将Rh Gel（由加热溶解于碳酸氢钠溶液中并冷却后自组装形成）与SP-EVs结合，制备了稳定的三维网络结构。不同浓度（2, 4, 8 mg/mL）的Rh Sol和Rh Gel的照片及其紫外可见光谱和荧光光谱分析（图 2b-c）显示，随着Rh浓度增加，样品颜色加深且吸收峰和荧光强度增强。UV荧光光谱和Zeta电位分析（图 2d-e）表明Rh Gel具有较高的稳定性，适合用于药物递送系统。扫描电子显微镜（SEM）图像（图2f）揭示了Rh Gel表面光滑的外表皮层，有助于保持其稳定性和均匀性。照片对比（图2g）直观地展示了SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel以及Rh Gel@SP-EVs之间的差异，证实了复合材料的成功制备。紫外可见吸收光谱图（图2h）显示Rh Gel@SP-EVs同时具有SP-EVs特有的680 nm吸收峰和Rh Gel的435 nm吸收峰，证明了两种成分的有效结合。Zeta电位分析（图2i）表明Rh Gel@SP-EVs的Zeta电位较Rh Gel有所降低，但不影响其整体稳定性。不同pH值条件下从Rh Gel@SP-EVs中释放的Rh的照片（图2j）及详细记录的PBS溶液中不同pH值下的Rh释放动力学曲线（图2k）显示，在酸性环境下（pH 5.5），Rh的累积释放率达到92%，而在中性环境下（pH 7.4）仅为68%，表明该系统具有显著的pH响应性释放特性。综上所述，Rh Gel@SP-EVs不仅成功结合了SP-EVs的生物活性成分和Rh Gel的物理化学特性，还展示了良好的稳定性和pH响应性药物释放特性，适用于模拟炎症环境下的药物递送。

图2. Rh Gel@ SP-EV的合成、表征和药物释放。（a）Rh Gel@ SP-EV的合成程序；（b）显示不同Rh浓度（2、4、8 mg/mL）的Rh溶胶和Rh Gel形成的照片；（c）在2、4和8 mg/mL的不同Rh浓度下，分析了Rh溶胶和Rh Gel样品的UV−Vis和荧光光谱（d）；（e）Rh溶胶和Rh Gel样品的Zeta电位（n = 3）；（f）Rh Gel样本的代表性SEM图像，比例尺 = 1 μm；（g）SP-EV、Rh溶胶、Rh Gel和Rh Gel在SP-EV上的照片；（h）不同基团的紫外-Vis吸收光谱；（i）各组的Zeta电位（n = 3）；（j）在不同pH水平（pH 5.5和7.4）下，从Rh Gel@ SP-EV在PBS溶液中获得的Rh释放介质的照片；（k）在不同pH值的PBS溶液中，Rh从Rh Gel@ SP-EV的释放动力学（n = 3）。数据表示为平均值 ± SD

（3）Rh Gel@ SP-EV的细胞毒性和细胞摄取

图3a展示了使用CCK-8实验测定软骨细胞系ATDC5细胞与不同处理物（PBS、SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel和Rh Gel@SP-EVs）共孵育1、2、3天后的细胞活力情况，结果显示Rh Gel@SP-EVs（Rh 5 μg/mL和SP-EVs 20 μg/mL）在共孵育期间对细胞活力影响极小，表明其具有良好的生物相容性。图3b通过活/死细胞染色进一步验证了Rh Gel@SP-EVs在这些浓度下无明显细胞毒性。为了观察SP-EVs的细胞摄取效率，研究人员用膜标记染料PKH67标记SP-EVs，并利用共聚焦显微镜成像（图3c），发现SP-EVs能够高效地进入ATDC5细胞的细胞质中，证明了其良好的细胞穿透能力。此外，体内荧光成像（图3d）显示了PKH67标记的SP-EVs在小鼠膝关节软骨细胞内的累积情况，进一步证实了SP-EVs不仅能够进入细胞并递送分子货物，还能影响目标细胞的生物学功能。综上所述，这些结果验证了SP-EVs被软骨细胞摄取的能力，突显了这些纳米囊泡在向细胞传递生物活性分子方面的潜力。

图3. Rh Gel@ SP-EV的细胞毒性和细胞摄取。（a）通过用SP-EV、Rh Sol、Rh Gel和Rh Gel@ SP-EV干预1、2和3天来评估ATDC 5细胞的活力，CCK-8测定结果（n = 3），数据表示为平均值 ± SD；（b）用各组处理1、2和3天后ATDC 5细胞的钙黄绿素-AM/PI染色，绿色表示活细胞，红色表示死细胞，比例尺 = 100 μm；（c）ATDC 5细胞中SP-EV的细胞摄取，细胞核（蓝色），SP-EV（用PKH 67标记，绿色），比例尺 = 50 μm；（d）膝关节组织切片中SP-EV的细胞摄取，细胞核（蓝色），SP-EV（用PKH 67标记，绿色），比例尺 = 100 μm

（4）Rh Gel@ SP-EV对线粒体功能障碍的缓解作用

图4a和4b展示了通过DCFH-DA荧光探针检测ATDC5细胞内ROS水平的结果，表明Rh Gel@SP-EVs显著降低了ROS生成（P<0.01），相较于单独使用SP-EVs、Rh Sol或Rh Gel也显示出中等程度的ROS减少。透射电子显微镜（TEM）图像（图4c）显示，TNF-α处理导致严重的线粒体损伤，包括肿胀、肥大和嵴结构破坏；而SP-EVs和Rh Gel@SP-EVs处理显著改善了这些损伤，恢复了线粒体的正常形态和嵴结构。JC-1染色实验（图4d-e）进一步证明Rh Gel@SP-EVs能够显著提高线粒体膜电位（ΔΨm），红/绿荧光比率从5.9恢复至10.4。Western blot分析（图4f-h）显示，Rh Gel@SP-EVs增加了线粒体转录因子A（TFAM）和ATP合酶（ATPB）的表达，这表明它促进了线粒体生物发生并提高了ATP含量（图4i-j）。免疫荧光分析（图 4i和S10）同样证实了ATP含量的显著增加。这些结果共同表明，Rh Gel@SP-EVs不仅显著减少了氧化应激，还通过增强线粒体功能和能量代谢来改善细胞健康，具有重要的治疗潜力。

图4. Rh Gel@ SP-EV对ROS、线粒体功能障碍和细胞能量代谢的保护作用。（a）在NC、TNF-α、SP-EV、Rh Sol、Rh Gel和Rh Gel@ SP-EV条件下，用DCFH-DA处理的ATDC 5细胞中细胞内ROS水平的荧光图像，DCFH-DA（绿色），细胞核（蓝色），比例尺 = 200 μm；（b）不同处理后ATDC 5细胞中DCFH-DA的表达率；（c，d）在各种条件下处理的ATDC 5细胞的TEM图像（c）和JC-1染色（d），JC-1的聚集体为红色，而JC-1的单体为绿色；（e）分析JC-1染色的红/绿色强度的平均荧光比（n = 3）；（f−h）在不同条件下ATDC 5细胞中TFAM和ATPB的蛋白质印迹结果；（h）不同条件下ATDC 5细胞中ATPB蛋白表达水平的定量（n = 3）；（i）不同条件下ATDC 5细胞中ATPB的免疫荧光染色，ATPB（绿色），细胞核（蓝色），比例尺 = 100 μm；（j）ATDC 5细胞在不同条件下的ATP水平；（k）Rh Gel@ SP-EV拯救炎症诱导的线粒体功能障碍并减少活性氧（ROS）产生，从而增强ATP合成的机制示意图

（5）Rh Gel@ SPEV的促合成代谢和抗代谢作用

图5a提供了实验设计的示意图，通过RT-PCR分析TNF-α诱导的ATDC5细胞中的炎症因子表达（图5b），结果显示TNF-α显著上调了IL-6和IL-1β等炎症标记物的表达。为了评估合成代谢相关基因的表达，研究人员检测了Sox9和Col2a1的表达水平（图5c），发现TNF-α处理显著下调了这些基因的表达。此外，分解代谢相关基因如Mmp13和Adamts4/5的表达水平也显著增加（图5d）。然而，SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel以及Rh Gel@SP-EVs的应用有效抑制了IL-6和IL-1β mRNA的上调，并缓解了Sox9和Col2a1的下调（图5e-f）。Western blot分析（图5g）进一步验证了Rh Gel@SP-EVs显著降低了MMP13和ADAMTS5的蛋白质表达，减少了基质降解并促进了软骨基质的合成。这些结果表明，Rh Gel@SP-EVs不仅能够减轻炎症反应，还能促进软骨细胞的合成代谢并抑制其分解代谢，为治疗骨关节炎提供了新的潜在策略。

图5. Rh Gel@SP-EVs对ECM合成代谢与分解代谢平衡调节的影响。（a）软骨细胞内环境平衡的示意图。软骨细胞的平衡是通过ECM合成代谢和分解代谢的动态相互作用来维持的，由降解相关酶和合成相关酶进行机械调节；（b−d）实时定量PCR（RT-PCR）检测TNF-α、SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel和Rh Gel@SP-EVs处理后ATDC 5细胞中的相对mRNA表达（IL-6、IL-1β、Sox 9、Col 2a 1、Mmp 13、Adamts 4和Adamts 5）（n = 3）；（e，f）在各种条件下对ATDC 5细胞中的SOX 9、COL II和MMP 13进行免疫荧光染色和定量，比例尺 = 100 μm；（g）在各种条件下，ATDC 5细胞中各种蛋白（SOX 9、COL II和MMP 13）的表达水平的蛋白质印迹定量（n = 3）

（6）Rh Gel@ SP-EV对JAK/STAT 3信号通路的抑制

图6a和6b展示了RNA测序结果，表明与TNF-α刺激组相比，SP-EVs处理组中有1116个基因下调，161个基因上调。基因集富集分析（GSEA）（图6c-e）显示，SP-EVs显著下调了与ROS途径相关的基因，并显著上调了与线粒体功能和氧化磷酸化相关的基因表达。KEGG通路分析（图6f）进一步确认了钙信号通路、细胞因子信号传导及JAK/STAT通路在SP-EVs处理后的显著变化。Western blot分析（图6h）显示，TNF-α处理显著增强了JAK2和STAT3的磷酸化水平，而SP-EVs和Rh Gel@SP-EVs处理显著降低了这些磷酸化水平。定量RT-PCR结果显示（图6i-j），TNF-α刺激后Jak1、Jak2和Jak3 mRNA表达显著上调，而在SP-EVs和Rh Gel@SP-EVs干预后，Jak2和Jak3 mRNA表达显著下调，Jak1则显示出下调趋势但未达到统计学意义。这些结果表明，Rh Gel@SP-EVs通过精确靶向抑制JAK2磷酸化来失活JAK2/STAT3信号通路，从而发挥抗炎作用，并且通过减少氧化应激和促进能量代谢来改善软骨细胞的功能。

图6. 线粒体能量代谢与炎症调控机制。（a）热图显示TNF-α刺激后SP-EV处理ATDC 5细胞中差异表达的基因；（b）火山图显示161个基因的表达上调，1116个基因的表达下调；（c−g）GSEA用于评估和对比ROS（c）、线粒体基因表达（d）、氧化磷酸化（e）和IL-6/JAK/STAT 3信号通路（g）中基因组的富集；（f）ATDC 5细胞中差异表达基因的KEGG通路分析，用TNF-α刺激ATDC 5细胞，然后用SP-EV处理；（h）不同条件下ATDC 5细胞中各种蛋白质（p-JAK 2、JAK 2、p-STAT 3、STAT 3和β-肌动蛋白）的蛋白质印迹结果；（i−j）RT-PCR检测不同条件下ATDC 5细胞中相对mRNA表达（Jak 1、Jak 2、Jak 3和Stat 3）（n = 3）

（7）Rh Gel@ SP-EV对DMM诱导的OA的治疗作用

图7a提供了实验设计示意图，展示了通过每周一次的关节内注射PBS、SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel或Rh Gel@SP-EVs进行治疗前交叉韧带切断术（DMM）诱导的OA的过程。随后，通过微计算机断层扫描（micro-CT）分析（图7b），研究人员发现DMM诱导的小鼠表现出明显的软骨下骨损伤，表现为密集且紊乱的骨小梁结构；而经过Rh Gel@SP-EVs处理后，这些病理变化显著减轻，显示了较好的骨修复效果。H&E染色和番红O/快绿染色（图7c）进一步揭示了DMM组中严重的软骨退化、厚度减少和表面不规则；相比之下，Rh Gel@SP-EVs处理组显著改善了软骨表面完整性，并增加了软骨厚度和面积。OARSI评分（图7d）、糖胺聚糖（GAG）含量（图7e）以及软骨厚度（图7f）的定量分析均表明，Rh Gel@SP-EVs显著降低了OA的严重程度并促进了软骨再生。免疫荧光染色（图7g）则显示，在Rh Gel@SP-EVs处理组中，II型胶原（COL II）和聚集蛋白聚糖（ACAN）的表达显著增加，同时IL-6表达显著降低，这表明该复合物不仅促进了软骨基质的合成，还减少了炎症反应。

图7. Rh Gel@SP-EVs处理对DMM诱导的OA的体内治疗效果。（a）评价Rh Gel@SP-EVs治疗在DMM诱导的OA小鼠模型中的保护效力的示意图和实验设计；（b）关节软骨下骨的三维重建图像；（c）膝关节切片的H&E染色，对膝关节切片进行番红-O/固绿色染色，番红-O可将软骨染成红色；（d）OARSI评分的量化（n = 6）；（e）6份样品中GAG含量的分析；（f）关节软骨厚度的定量（n = 6）；（g）小鼠膝关节的代表性免疫荧光染色（COL II、ACAN和IL-6）

（8）Rh Gel@ SP-EV在MIAA诱导的OA中的治疗作用

图8a为实验设计示意图，描述了通过每周一次的关节内注射PBS、SP-EVs、Rh Sol、Rh Gel或Rh Gel@SP-EVs进行治疗单碘乙酸钠（MIA）诱导的OA的过程。随后，通过micro-CT分析（图8b），研究人员发现MIA处理的小鼠表现出显著的软骨下骨损伤，包括紊乱且密集的骨小梁结构；而Rh Gel@SP-EVs处理组则显著减轻了这些病理变化，显示了良好的骨修复效果。H&E染色和番红O/快绿染色（图8c）进一步揭示了MIA组中严重的软骨退化、厚度减少和表面不规则；相比之下，Rh Gel@SP-EVs处理组显著改善了软骨表面完整性，并增加了软骨厚度和面积。OARSI评分（图8d）、糖胺聚糖（GAG）含量（图8e）以及软骨厚度（图8f）的定量分析均表明，Rh Gel@SP-EVs显著降低了OA的严重程度并促进了软骨再生。免疫荧光染色（图8g）显示，在Rh Gel@SP-EVs处理组中，II型胶原（COL II）和聚集蛋白聚糖（ACAN）的表达显著增加，同时IL-6表达显著降低，这表明该复合物不仅促进了软骨基质的合成，还减少了炎症反应。

图8. Rh Gel@SP-EVs处理对MIA诱导的OA的体内治疗效果。（a）在MIA诱导的OA模型中评价Rh Gel@SP-EVs治疗有效性的示意图和实验设计；（b）关节软骨下骨的三维重建图像（通过显微CT分析）；（c）采用H&E染色以及番红-O/固绿色染色对小鼠关节切片进行组织学分析，番红-O可将软骨染成红色；（d）OARSI评分的量化（n = 6）；（e）GAG含量的定量（n = 6）；（f）关节软骨厚度的定量（n = 6）；（g）小鼠膝关节的代表性免疫荧光染色（COL II、ACAN、IL-6）

（9）Rh Gel@ SP-EV的体内生物相容性

血液学测试显示，所有治疗组与对照组相比，血液参数均在正常范围内，无显著差异，表明Rh Gel@SP-EVs未引起明显的全身毒性反应。接着，图9b展示了肝肾功能参数（包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA））的测定结果，结果显示这些指标在所有处理组中均保持在正常范围内，进一步证实了Rh Gel@SP-EVs的安全性。最后，图9c通过H&E染色对主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行了组织学分析，结果显示各组之间无显著炎症或其他不良反应，表明Rh Gel@SP-EVs具有良好的体内生物相容性。

图9. Rh Gel@ SP-EV的体内生物相容性。（a）不同处理后小鼠的血液学检查（n = 3），包括：白色细胞（WBC）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、血红蛋白（HGB）和红细胞（RBC）；平均红细胞血红蛋白浓度平均值（MCHC）、细胞体积（MCV）；血小板（PLT）；血红蛋白浓度（HCT）；（b）不同处理后小鼠的血清生化分析（n = 5），包括：ALT（丙氨酸转移酶）、AST（天冬氨酸转移酶）、BUN（血尿素氮）、CREA（肌酐）；（c）在给药后，使用H&E染色对小鼠的主要器官（包括心、肝、脾、肺、肾和膝关节）进行组织学分析