针对上述问题，中国医学科学院李稳团队开发了一种 pH 响应型光动力探针 TI，并将其与具有 ROS 反应的一氧化碳（CO）供体组装在一起，然后封装在基于 HA 的微针贴片中，最终形成了治疗微针平台。微针结构增强了分子探针和一氧化碳供体对伤口感染部位生物膜的机械渗透。当遇到伤口的酸性微环境时，TI 会发生动态分子结构变化，从而产生显著的近红外荧光输出，用于检测感染并评估其严重程度。与此同时，纳米探针还能释放其产生 ROS 的潜能，这不仅能通过氧化损伤直接消灭细菌，还能触发 CO 的释放，用于辅助气体治疗。总之，集成诊断和治疗微针平台为解决伤口感染和减轻抗生素耐药性带来的挑战提供了一种前景广阔的方法，为感染护理管理领域带来了重大希望。该文章于2024年12月12日以《Bacterial Microenvironment-Responsive Microneedle Patches for Real-Time Monitoring and Synergistic Eradication of Infection》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202414834）。

图1 研究示意图

（1）pH触发的结构可变分子TI的合成及其光物理特性研究

图2（a）合成路径示意图展示了目标分子（TI）的合成步骤及关键中间体的形成。图2（b）结构转化机制为 TI 在不同 pH 条件下的结构变化示意图：碱性条件下 TI 呈闭环结构，酸性条件下环打开形成具有强电子受体特性的 D-A 结构。图2（c）为不同 pH 条件下 TI 的 NMR 谱图，酸性环境下出现新峰，表明分子结构变化。图2（d）吸收光谱展示了不同 pH 值下 TI 的 UV-Vis 吸收光谱，pH 下降时 550 nm 处吸收峰增强，表明结构转变。图2（e）通过 550 nm 处吸光度变化曲线计算出 TI 的 pKa 值约为 6.39，适用于检测弱酸性感染环境。图2（f）荧光光谱显示 TI 的荧光强度随 pH 下降而增强，表现出显著的 “off-to-on” NIR 荧光响应。图2（g）荧光成像显示不同 pH 条件下 TI 的荧光图像，酸性环境下荧光信号显著增强。图2（h）TI 在 pH 8 和 pH 3 之间循环 5 次后，吸收信号无明显衰减，证明其可逆性和稳定性。图2（i）光照下，TIOH 的吸收几乎不变，而 ICG 快速衰减，表明 TIOH 具有优异的光稳定性。图2（j）选择性测试显示 TI 在多种生物相关物质存在下对 pH 具有高选择性，受干扰小。整体来看，TI 具有优异的 pH 依赖性荧光响应、良好的稳定性和高选择性，是理想的感染诊疗探针。

图2. pH触发的结构可变分子TI的合成及其光物理特性研究。（a）TI的合成路线；（b）TI的pH响应结构转变；（c）TI在酸性和碱性条件下的¹H NMR；（d）TI在不同pH值下的吸收率和溶液颜色；（e）根据滴定拟合曲线得到的pKa；（f）TI在不同pH值下的荧光光谱；（h）TI分子在pH 3（红圈）和pH 8（蓝圈）之间切换五个周期时的可逆吸光度；（i）ICG和TIOH在白光（0.1 W cm⁻²）照射8分钟后的紫外吸收（I₅₅₀）变化；（j）TI在不同生物干扰物存在下的荧光变化

（2）TI在不同pH条件下的光动力学效应研究

图3a展示了在酸性条件下，TI分子在光照下产生活性氧（ROS）的能力。随着光照时间增加，DPBF的吸光度在412 nm处显著下降，表明ROS生成。图3b显示不同pH条件下，TI和DPBF混合物在光照下的吸光度变化，只有在酸性条件（pH 5）下，TI才能有效产生ROS。图3c展示了在酸性条件下，TI分子在光照下产生单线态氧（¹O₂）的能力，ABDA的吸光度在光照下迅速下降，表明¹O₂生成。图3d显示在酸性条件下，TI分子在光照下产生羟基自由基（•OH）的能力，TMB的吸光度在光照下显著增加，确认了•OH生成。图3e通过电子自旋共振（ESR）光谱确认了TI分子在光照下产生¹O₂和•O₂⁻的能力，使用TEMP和DMPO作为自旋捕获剂，分别检测到了¹O₂和•O₂⁻的特征信号。图3f展示了TI和酸激活的TIOH的能级结构，理论计算表明，酸激活的TIOH具有更小的能带隙（2.61 eV），有助于更高效的系间窜跃（ISC）过程，从而增强ROS的生成能力。这些图表共同说明了TI分子在酸性条件下具有显著的ROS生成能力，包括¹O₂和•OH，并且这种能力可以通过光照触发。此外，酸激活的TIOH由于其更小的能带隙，表现出更高效的ISC过程，从而增强了ROS的生成。这些特性使TI成为一个有潜力的光动力治疗（PDT）候选物，用于精确和高效地治疗感染。

图3. TI在不同pH条件下的光动力学效应研究。（a）在酸性pH值（pH = 5）下，白光照射（0.1 W cm⁻²）下有TI存在时，DPBF的吸光度变化；（e）通过电子自旋共振（ESR）光谱证实TI的I型和II型光动力治疗（PDT）效应；（f）计算出的TI（原始形式）和TIOH（酸性形式）的分子几何形状、最高占据分子轨道（HOMO）、最低未占据分子轨道（LUMO）以及能级

（3）TI纳米颗粒的光物理特性和生物相容性研究

图4a展示了TI纳米颗粒（NPs）的粒径分布和透射电子显微镜（TEM）图像。动态光散射（DLS）数据显示平均粒径为126 nm，多分散指数（PDI）为0.15，TEM图像确认了颗粒的均匀球形结构，平均直径约为110 nm。图4b显示了不同pH值下TI纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。随着pH值的降低，TI纳米颗粒在342 nm处的吸收强度逐渐减弱，同时在550 nm处出现了新的吸收峰，表明其具有pH响应的光物理特性。图4c展示了在酸性条件下，TI纳米颗粒在光照下产生活性氧（ROS）的能力。随着光照时间的增加，DPBF的吸光度逐渐降低，表明TI纳米颗粒能够有效产生ROS。图4d显示了在酸性条件下，TI纳米颗粒在光照下释放一氧化碳（CO）的能力。随着光照时间的延长，CO探针的荧光强度显著增强，表明TI纳米颗粒能够控制释放CO。图4e展示了TI纳米颗粒对L929小鼠成纤维细胞的细胞活力影响。结果表明，在不同浓度下，TI纳米颗粒对细胞的毒性很低，即使在光照条件下，细胞存活率也保持在86%以上。图4f通过细胞骨架染色实验，展示了TI纳米颗粒对细胞结构的影响。结果显示，处理后的细胞结构没有显著变化，表明TI纳米颗粒对细胞结构影响较小。图4g通过活/死细胞共染色实验，展示了TI纳米颗粒对细胞存活率的影响。结果显示，处理后的细胞主要显示绿色荧光（活细胞），红色荧光（死细胞）很少，表明TI纳米颗粒对细胞的毒性很低。这些图表共同说明了TI纳米颗粒具有良好的生物相容性、pH响应的光物理特性以及在酸性条件下产生ROS和释放CO的能力，使其成为一种有潜力的抗菌纳米剂。

图4. TI纳米颗粒的光物理特性和生物相容性研究。（a）TI NPs的DLS和TEM分析；（b）不同pH值下TI NPs的吸光度；（c）在酸性pH值下，DPBF暴露于TICO NPs +白光（0.1 W cm⁻²）下的吸光度变化；（d）CO探针在其特征峰值515 nm处的荧光强度，表明不同体系中CO的释放水平；（f）细胞骨架染色；（g）L929细胞在不同处理下的活/死染色，比例尺为200 µm

（4）TICO纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌能力评估

图5a和5b展示了在黑暗和光照条件下，不同处理（PBS、CO NPs、TI NPs、TiCO NPs）对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）在琼脂平板上生长的影响。可以观察到，只有TiCO NPs在光照条件下显著抑制了细菌的生长。图5c显示了不同处理条件下，S. aureus和E. coli的菌落形成单位（CFU/mL）的对数值。结果表明，TiCO NPs在光照条件下对两种细菌都有很强的杀菌效果，杀菌效率分别达到约98.3%和99.9%。图5d和5e通过扫描电子显微镜（SEM）观察了不同处理条件下细菌的形态变化。可以看到，经过TiCO NPs处理并在光照条件下的细菌细胞壁受到严重损伤，出现了广泛的破裂和塌陷，而单独使用TiCO NPs或光照处理的细菌结构相对完整。图5f和5g通过活/死细胞共染色实验，展示了不同处理条件下细菌的存活情况。使用Syto9（绿色荧光）标记活细胞，使用PI（红色荧光）标记死细胞。结果表明，TiCO NPs在光照条件下处理的细菌主要显示红色荧光，表明其具有很高的杀菌效果。综合这些结果，可以看出TiCO纳米颗粒在光照条件下对S. aureus和E. coli都表现出显著的杀菌效果。这种效果主要归因于光动力疗法（PDT）和一氧化碳（CO）的协同作用，它们共同破坏细菌的细胞壁和细胞膜，最终导致细菌细胞膜的收缩甚至破裂。这些发现为TiCO纳米颗粒作为一种有效的抗菌剂提供了有力的证据。

图5. TICO纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌能力评估。（a）不同处理后平板上金黄色葡萄球菌的代表性照片；（b）不同处理后平板上大肠杆菌的代表性照片；（d）不同处理后金黄色葡萄球菌的代表性扫描电镜图像（刻度线为2微米）；（e）不同处理后大肠杆菌的代表性扫描电镜图像（刻度线为2微米）；（f）不同组别金黄色葡萄球菌的活（绿色荧光）/死（红色荧光）染色图像，比例尺为100微米；（g）不同组别大肠杆菌的活（绿色荧光）/死（红色荧光）染色图像，比例尺为100微米。光照组的样品在白光（0.1 W cm⁻²）下照射10分钟

（5）TICO@MN贴片的制备及其机械性能和生物相容性研究

图6a展示了微针（MN）贴片的制备过程。首先，将TiCO纳米颗粒与高分子量透明质酸（HMHA）混合形成预水凝胶溶液，然后倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，经过真空脱气和干燥。接着，在微针表面涂覆低分子量透明质酸（LMHA），离心形成独立层，最后干燥后从模具中剥离。图6b和6c通过扫描电子显微镜（SEM）观察了微针的形态。可以看到，制备的TiCO@MN呈现出有序排列的10×10尖顶金字塔形微针，每个微针的高度为1000 µm，底部宽度为500 µm，中心间距为550 µm。图6d展示了微针的分离过程。通过在微针中加载罗丹明B（RhB）染料，并将微针贴片浸入PBS溶液中，观察微针与背衬层的分离情况。图6e通过光学显微镜实时观察微针在接触水溶液后的分离状态。结果表明，微针在接触水溶液后迅速从背衬层分离，2分钟内完成分离。图6f展示了TiCO@MN的机械强度测试结果。通过压缩测试，TiCO@MN表现出与透明质酸微针（HA MN）相似的机械强度，每个微针的压缩力约为2.3 N，足以穿透角质层屏障。图6g展示了TiCO@MN在新鲜猪皮上的穿透能力。通过施加拇指压力，微针贴片可以轻松插入皮肤，留下清晰整齐的针孔，表明其优异的皮肤穿透能力。图6h通过苏木精和伊红（H&E）染色进一步确认了微针穿透角质层并进入表皮层，穿透深度约为150 µm。图6i展示了TiCO@MN的细胞相容性测试结果。通过CCK8法测定细胞活力，结果表明TiCO@MN具有较高的细胞相容性。综上所述，TiCO@MN贴片通过结合机械穿透和控制释放的优势，具有很好的潜力用于按需经皮感染管理。

图6. TICO@MN贴片的制备及其机械性能和生物相容性研究。（a）TICO@MN贴片的制备过程示意图：将TICO NPs与高分子量透明质酸（HMHA）溶液混合后倒入PDMS模具中，反复真空脱气和干燥；（b）TICO@MN的光学图像；（c）TICO@MN的扫描电镜图像；（d）加载了罗丹明B（RhB）的MN贴片的光学图像；（e）光学图像显示MN主体在PBS中培养一段时间后与背衬层的分离情况；（f）HA MN和TICO@MN贴片机械压缩强度的测量；（g）小鼠皮肤贴上含RhB的MN贴片后的代表性照片和荧光图像；（h）经TICO@MN处理后的小鼠皮肤苏木精-伊红（H&E）染色图像；（i）采用CCK-8法评估TICO@MN在光照下对L929小鼠成纤维细胞的细胞毒性

（6）TICO@MN贴片的pH响应传感和抗菌性能研究

图7a展示了在不同pH值条件下，TiCO纳米颗粒在凝胶中的荧光强度。结果表明，在酸性环境中（pH 3-5），TiCO纳米颗粒显示出较强的近红外（NIR）发射，而在碱性或中性环境中（pH 6-9），荧光强度较弱。这表明TiCO纳米颗粒具有良好的pH响应能力。图7b展示了不同处理条件下，金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜在结晶紫染色后的生物量。可以看到，TiCO@MN在光照条件下处理的生物膜生物量显著减少，表明其具有很好的抗生物膜效果。图7c通过结晶紫染色定量分析了不同处理条件下生物膜的生物量。结果显示，TiCO@MN在光照条件下处理的生物膜生物量减少了约60%，显著高于其他处理组。图7d通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对生物膜中的活细菌进行3D重建染色。可以看到，TiCO@MN在光照条件下处理的生物膜中活细菌显著减少，绿色荧光较弱。图7e定量分析了不同处理条件下生物膜中活细菌的比例。结果显示，TiCO@MN在光照条件下处理的生物膜中活细菌比例仅为约9.7%，显著低于其他处理组。综上所述，TiCO@MN贴片在光照条件下对金黄色葡萄球菌生物膜表现出优异的破坏和杀菌效果，主要归因于光动力疗法（PDT）和一氧化碳（CO）气体疗法的协同作用。这些结果表明，TiCO@MN贴片在抗感染治疗中具有良好的应用前景，特别是在对抗生物膜感染方面。

图7. TICO@MN贴片的pH响应传感和抗菌性能研究。（a）在IVIS（活体成像系统）下观察到的TICO@MN贴片应用于不同pH值凝胶的近红外荧光图像；（b）不同处理下，通过水晶紫染色的生物膜的代表性照片；（d）不同处理后，用SYTO9染色的金黄色葡萄球菌（SA）生物膜的三维共聚焦图像，比例尺为500 µm；（e）根据（d）中描述的染色图像分析，对不同组SA生物膜内细菌存活率进行定量评估，数据以平均值±标准差（SD）表示（n = 3个独立实验重复）。光照组的样品在白光（0.1 W cm⁻²）下照射10分钟

（7）TICO@MN在体内监测感染部位pH变化的能力评估

图8a展示了在小鼠感染模型中实时监测pH变化的实验流程。首先，在BALB/c小鼠的背部皮肤上创建一个直径为8毫米的圆形伤口，然后接种金黄色葡萄球菌（S. aureus）悬液以诱导感染。在细菌接种后的2、6、12和24小时时间点，将TiCO@MN贴片植入感染伤口中，以评估其监测感染微环境的能力。图8b展示了在不同时间点（0、2、6、12、24小时）感染后，TiCO@MN贴片在小鼠伤口部位的荧光成像。可以看到，随着感染的进展，TiCO@MN贴片发出的红色荧光信号逐渐增强，特别是在感染后12小时达到峰值。图8c定量分析了不同时间点（0、2、6、12、24小时）TiCO@MN贴片的荧光强度。结果表明，感染后12小时的荧光强度显著高于其他时间点，表明TiCO@MN贴片能够有效地监测感染的进展。图8d展示了在不同感染严重程度（1×10^6、1×10^7、1×10^8 CFU/mL）下，TiCO@MN贴片在小鼠伤口部位的荧光成像。可以看到，初始细菌浓度越高，感染部位的近红外（NIR）荧光信号越强。图8e定量分析了不同感染严重程度下TiCO@MN贴片的荧光强度。结果表明，初始细菌浓度越高，荧光强度越大，表明TiCO@MN贴片能够区分不同感染严重程度。综上所述，TiCO@MN贴片在体内实验中表现出优异的pH响应特性，能够有效地监测感染微环境的pH变化，并区分不同感染严重程度。这些结果表明，TiCO@MN贴片在实时监测感染进展和评估感染严重程度方面具有显著的潜力。

图8. TICO@MN在体内监测感染部位pH变化的能力评估。（a）利用TICO@MN制作细菌伤口感染模型并进行感染成像的过程示意图；（b）TICO@MN处理的伤口在细菌接种后不同时间点的代表性IVIS（活体成像系统）图像；（d）TICO@MN处理过的不同严重程度伤口的代表性IVIS图像，这些伤口是由不同细菌负荷的挑战伤口诱发的；（e）基于（d）中的荧光图像，对感染部位荧光强度的相应量化分析

（8）TICO@MN在小鼠皮下感染模型中的抗菌和伤口愈合能力评估

图9a展示了小鼠皮下感染模型的实验流程。首先在小鼠背部皮肤上创建伤口，然后接种金黄色葡萄球菌（S. aureus）以诱导感染。在感染12小时后，将感染的小鼠随机分为六组，分别进行不同的处理：1）PBS，2）仅光照，3）TiCO@MN，4）Ti@MN + 光照，5）TiCO NPs + 光照，或6）TiCO@MN + 光照。在涉及光照治疗的情况下，小鼠的伤口在给药后暴露于强度为0.1 W/cm²的白光下10分钟。图9b展示了不同处理组在治疗期间伤口愈合的进展情况。可以看到，TiCO@MN + 光照组的伤口愈合速度最快，愈合效果最好。图9c定量分析了不同处理组的伤口闭合率。结果表明，TiCO@MN + 光照组的伤口闭合率最高，达到约87%，显著高于其他组。图9d通过H&E染色对第七天的伤口组织进行组织学检查。可以看到，TiCO@MN + 光照组的炎症反应显著减少，伤口感染几乎完全消退，伴有成纤维细胞和新形成的上皮结构。图9e展示了不同处理组的伤口细菌菌落计数。可以看到，TiCO@MN + 光照组的细菌菌落数显著减少，表明其具有优异的杀菌效果。图9f定量分析了不同处理组的伤口细菌菌落数。结果表明，TiCO@MN + 光照组的细菌数量减少了96.3%，显著高于其他组。图9g通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析了感染组织中IL-6和TNF-α的水平。可以看到，TiCO@MN + 光照组的IL-6和TNF-α水平显著低于其他组，表明其能够有效抑制炎症反应。图h定量分析了不同处理组的IL-6水平。结果表明，TiCO@MN + 光照组的IL-6水平最低，进一步证实了其抗炎效果。

综上所述，TiCO@MN贴片在小鼠皮下感染模型中表现出优异的抗菌和促进伤口愈合的能力。TiCO@MN + 光照组不仅能够有效清除感染，还能够调节局部免疫环境，促进组织再生。这些结果证实了TiCO@MN贴片在感染成像和抗菌治疗中的潜力和良好的生物安全性。

图9. TICO@MN在小鼠皮下感染模型中的抗菌和伤口愈合能力评估。（a）TICO@MN体内抗菌和伤口愈合能力评估程序的示意图；（b）不同时间点小鼠伤口的代表性照片，经过不同处理后；（c）不同组别在不同时间点伤口愈合率的定量分析；（d）第7天不同组别伤口组织的代表性苏木精-伊红（H&E）染色图像，黄色箭头表示炎性细胞浸润；（e）不同组别伤口组织细菌培养板的代表性照片；（f）与（e）中细菌培养板结果相对应的不同组别CFU（菌落形成单位）计数定量分析；（g）不同处理后小鼠伤口内TNF-α水平的ELISA分析；（h）不同处理后小鼠伤口内IL-6水平的ELISA分析。数据以平均值±标准差（SD）表示（n = 3只小鼠）。光照组样品在白光（0.1 W cm⁻²）下照射10分钟