针对上述问题，山东大学张东姣团队开发一种基于黑磷（BP）和氨基硅酞菁（SiPc-NH₂）的纳米复合水凝胶（BP-PC@GelMA），通过非共价相互作用（如π-π堆积、静电作用）增强BP的分散性和稳定性，减少其氧化降解，并提升其光热性能和生物相容性。研究进一步探讨BP-PC@GelMA在骨缺损修复中的作用机制，特别是通过调控Hippo/Wnt信号通路和线粒体动态（融合/分裂、自噬）来促进成骨分化。最终目标是构建一种兼具成骨、抗菌和光热治疗功能的多功能骨修复材料，为临床治疗骨缺损提供新的策略和理论支持。该文章于2025年1月23日以《Improved Black Phosphorus Nanocomposite Hydrogel for Bone Defect Repairing: Mechanisms for Advancing Osteogenesis》为题发表于《Advanced Healthcare Materials》（DOI：10.1002/adhm.202404934）。

研究示意图

（1）BP和SiPc-NH2颗粒的生物相容性及合成比例研究

为了研究BP和SiPc-NH₂在细胞培养应用中的最佳浓度，首先评估了BP和SiPc-NH₂对大鼠成骨细胞（rOBs）活力的影响。通过CCK-8检测了1、3、5天后的细胞增殖情况，结果显示在1 μM浓度下，BP和SiPc-NH₂的增殖活性随时间变化显著不同。SiPc-NH₂在第3天和第5天表现出增殖增加，表明其对细胞活力具有时间依赖性增强作用。相反，BP在同一时间段内增殖活性下降，表明其对细胞活力具有时间依赖性抑制作用（图1b）。通过活死染色检测BP和SiPc-NH₂颗粒，结果显示所有组中均有大量活细胞，仅少数细胞死亡，与阴性对照组（NC组）相比无显著差异（图1a,c）。

随后，采用碱性磷酸酶（ALP）染色法评估BP对rOBs成骨分化的调控作用，并探索BP和SiPc-NH₂的最佳成骨浓度。结果表明，BP浓度为6μg/mL时，ALP染色强度最高，表明其成骨潜力最强。而在较低（1μg/mL）和较高（12μg/mL）浓度下，ALP染色强度减弱，表明成骨能力下降（图1d）。此外，研究发现SiPc-NH₂浓度在0至75 mg/L范围内，ALP染色结果无显著差异，表明该浓度范围内无明显成骨效果。因此，确定了BP与SiPc-NH₂的最佳合成比例为1:10，即少量BP与足量SiPc-NH₂充分混合。

图1. BP和SiPc-NH2粒子的生物相容性和合成比例的研究。（a）来自NC、SiPc-NH₂和BP组中的活/死测定的代表性图像；（b）来自NC、SiPc-NH₂和BP组的CCK-8测定的OD值；（c）显示每平方毫米活细胞和死细胞数目的活/死测定；（d）不同浓度的BP和SiPc-NH₂的ALP染色

（2）BP-SiPc-NH₂的表征

采用液相剥离法制备BP纳米片，以NMP为剥离剂，有效防止其降解并提高产率。SEM显示BP为二维片状结构，液相剥离后形成更小纳米片（图2a）。EDS分析显示氮、磷、碳和硅在BP表面均匀分布，证明SiPc-NH₂成功负载（图2b）。FT-IR中出现SiPc-NH₂特征峰，进一步确认其负载（图2c）。XPS分析显示P2p₁/₂和P2p₃/₂峰分别在129.7 eV和130.7 eV，额外峰在133.7 eV处（图2d,e）。SiPc-NH₂的引入增加了NIR驱动的ROS生成量（图2f），改善了BP纳米片的分散性（图2g），可能由于其两侧氨基基团扩展。比较BP和BP-PC的降解前后图像和紫外光谱，发现BP-PC一个月内部分降解，而BP显著降解（图2h,i）。20 W NIR光照射时，SiPc-NH₂显著提高加热速率（图2j,k）。因此，SiPc-NH₂增强了BP的热生成和ROS产生能力，降低了降解速率，改善了分散性，有助于提高生物安全性和抗菌性能。图2i展示GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM图像，具有多孔表面结构。在PBS中降解一个月后，表面粗糙度增加甚至部分损伤，证实其优异的降解性能（图2m）。在SBF中浸泡两周后，水凝胶表面形成矿化晶体（图2n–q）。检测水凝胶加热效果，BP-PC组1分钟内温度超过40°C，具有快速升温杀灭病原菌的潜力（图2r,s）。

图2. BP、BP-PC、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的表征_{。（a）BP和BP-PC的TEM图像；（b）BP-PC的元素图谱；（c）BP和BP-PC的FT-IR光谱；（e）BP和BP-PC的XPS测量和高分辨率P2p谱；（f）BP和BP-PC在不同浓度（10、15、20 mg L}⁻¹）下的ROS生成量；（g）BP和BP-PC在不同浓度（10、15、20 mg L⁻¹）下的分散稳定性；（h）降解前后BP-PC的照片和UV光谱；（i）降解前后BP的照片和UV光谱；（j，k）在808 nm NIR光照射（功率密度为2.0 W cm⁻²）下，记录BP和BP-PC的温度变化；（l）GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM图像；（m）在不同组的PBS中降解一个月后的表面形态；（n-q）在SBF中浸泡两周后不同组的表面矿化结果；（r，s）当用808 nm NIR光（功率密度2.0 W cm⁻²）照射时，不同基团下的水凝胶的温度响应效应

（3）BP@GelMA和BP-PC@GelMA成骨性能的研究

为了进一步分析BP@GelMA和BP-PC@GelMA中的细胞活力，采用了活死染色技术。结果显示，所有实验组中均有大量活细胞，仅少数细胞死亡，与NC组相比无显著差异（图3a）。随后，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA的最佳成骨浓度，以确定后续实验的浓度。分析显示，在0–25 μg/mL浓度范围内，ALP染色结果与NC组相比有显著差异，显示出良好的成骨效果，且随着浓度增加效果增强（图3b）。综合考虑生物相容性和成骨潜力，后续实验中使用25 μg/mL的BP@GelMA和BP-PC@GelMA。

此外，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA对细胞迁移的影响。在培养12和24小时后，Transwell实验和划痕实验显示，两种材料均显著增强了rOBs的迁移能力（图3c,d）。值得注意的是，BP-PC@GelMA组的迁移细胞数量更多，显示出更显著的促迁移效果。此外，划痕实验表明，BP-PC@GelMA组在24小时后实现了100%的愈合率，凸显了其在促进细胞迁移和组织再生方面的功效。接下来，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA复合材料的成骨潜力。ALP是早期成骨细胞分化的关键标志物。在诱导的第7天，ALP染色显示BP-PC@GelMA组的ALP含量升高，表明BP-PC@GelMA涂层促进了成骨细胞分化（图3e）。在诱导的第14天，矿化结节的形成也显示出类似的结果，支持其作为晚期成骨分化的关键指标。在先前的研究中，已确定GelMA不影响rOBs的增殖或成骨分化。因此，未单独设置GelMA组进行比较分析。关于成骨相关蛋白的表达，BP-PC@GelMA组的RUNX2、ALP和COL-1水平显著升高（图3f）。

图3. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的成骨潜力研究_{。（a）存活/死亡试验的代表性图像；（b）不同浓度的BP@GelMA和BP-PC@GelMA的ALP染色；（c，d）在不同组下培养12和24小时后进行的Transwell和划痕试验；（e）每组ALP和ARS染色的代表性图像；（f）成骨分化相关蛋白ALP、COL-1和RUNX2在不同组间rOB中的表达水平}

（4）BP@GelMA和BP-PC@GelMA的体外光热抗菌效果研究

如图4a,b所示，在没有近红外（NIR）照射的情况下，所有实验组均显示出显著的细菌生长，琼脂平板上存在大量金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落。在NIR光照射3分钟后，BP@GelMA和BP-PC@GelMA组均表现出显著的光热效应。BP@GelMA组中仍残留少量孤立的细菌菌落，而BP-PC@GelMA组的菌落几乎完全被清除。将NIR照射时间延长至5分钟后，两组的细菌菌落数量急剧减少，几乎完全消失。进一步的定量分析表明，经过3分钟NIR照射后，BP@GelMA对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率分别达到98%和99.7%。5分钟后，抗菌率保持在100%。对于BP-PC@GelMA组，仅需3分钟NIR照射即可对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌达到100%的抗菌率，5分钟后效果仍保持在100%。相应的扫描电子显微镜（SEM）图像显示，SiPc-NH₂的引入增强了NIR辐射触发的抗菌效果。这些效果表现为显著的细胞皱缩、细菌聚集和模糊的细胞边界，表明细菌细胞壁结构受损。活死染色显示，BP-PC@GelMA组中活菌密度较低，需进一步研究（图4c）。总体而言，这些发现证实了光热疗法能够有效破坏微生物结构，导致其死亡和清除（图4d）。

图4. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的体外光热抗菌作用_{。（a）金黄色葡萄球菌（S. aureus）在808 nm近红外光（功率密度2.0 W cm}⁻²）照射3分钟和5分钟后的生长情况；（b）大肠杆菌（E. coli）在808 nm近红外光（功率密度2.0 W cm⁻²）照射3分钟和5分钟后的生长情况；（c）BP和BP-PC处理之前和之后，细菌的SEM图像及细菌菌落的代表性活/死测定图像；（d）BP-PC抗菌机理示意图

（5）BP-PC@GelMA增强大鼠颅骨缺损的体内修复

为了评估体内骨再生的效果，将三种不同的水凝胶构建体GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA植入SD大鼠的颅骨缺损中，持续4周或8周（图5a）。术后所有四组SD大鼠恢复良好，未出现因实验干预导致的死亡。

为了研究BP-PC@GelMA水凝胶对骨缺损愈合的影响，通过Micro-CT分析观察了NC组、GelMA组、BP@GelMA组和BP-PC@GelMA组中新骨的形成情况。术后4周和8周，NC组和GelMA组在手术区域显示出明显的骨缺损。相比之下，BP-PC@GelMA组与其他三组相比，新骨形成显著增强（图5b）。通过定量形态学分析感兴趣区域（ROI），BP-PC@GelMA组在术后4周的骨体积与组织体积比（BV/TV）显著高于其他三组。术后8周，BP-PC@GelMA组的BV/TV达到68.08%，显著超过其他组。此外，术后4周，BP-PC@GelMA组的骨小梁分离度（Tb.Sp）为0.72μm，显著低于其他组。术后8周，BP-PC@GelMA组的Tb.Sp为0.45μm，显著低于其他组（图5c）。

通过HE染色和Masson三色染色评估新骨的质量和数量。结果显示，在术后4周时，BP@GelMA和BP-PC@GelMA组显示出显著的骨再生增强。这些组中新骨小梁的形成增加，表明成骨活性增强。在术后8周时，BP@GelMA和BP-PC@GelMA组显示出新骨体积的逐步增加，其缺损边缘和表面，成熟骨呈现深红色，与NC组和GelMA组中蓝色染色的新骨形成鲜明对比，表明BP@GelMA和BP-PC@GelMA支架在再生过程中促进了更高水平的矿化和成熟（图5d）。为了进一步研究骨再生过程中的成骨分化，进行了碱性磷酸酶（ALP）和I型胶原（COL-1）的免疫组化（IHC）染色。BP-PC@GelMA组中ALP和COL-1阳性细胞数量显著高于其他两组（图5e）。这表明BP-PC@GelMA有效增强了成骨分化并促进了骨再生。

图5. BP-PC@GelMA可增强颅骨缺损的体内修复_{。（a）大鼠治疗方案示意图；（b）大鼠颅骨缺损的三维micro-CT扫描图像；（c）骨体积分数（BV/TV）和骨小梁间距（Tb.Sp.）的定量分析；（d）术后4周和8周时颅骨缺损的苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色图像；（e）颅骨缺损后8周进行的碱性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型胶原（COL-1）免疫组化（IHC）染色}

（6）对BP-PC@GelMA处理的rOBs进行定量蛋白质组学测序分析

通过设定阈值（|log2 FC|≥0 and q-value≤0.05），筛选出差异表达蛋白（DEGs）。火山图显示，BP-PC@GelMA组中共有254个基因表达发生显著变化，其中157个上调，97个下调（图6a）。热图中展示了前20个差异最显著的基因（图6b）。关键差异基因：Sle25a11（维持线粒体融合/分裂事件及嵴的形态，通过调节线粒体谷胱甘肽水平抑制细胞凋亡）、SDHC（参与线粒体电子传递链复合体II）、Hk2（维持线粒体外膜完整性，防止促凋亡分子释放）、STX17（调控自噬体与溶酶体膜的融合）和 Mtfr11（调控线粒体形态稳态及AMPK依赖的应激诱导线粒体碎片化）。亚细胞定位分析显示，12.2%的差异蛋白定位于线粒体（图6c）。KEGG通路富集分析表明，BP-PC的成骨机制可能与溶酶体、自噬、氧化磷酸化及三羧酸循环（TCA）相关（图6d）。进一步分析发现，Hippo和Wnt信号通路显著富集（图6e）。基因本体（GO）富集分析显示，11.24%的差异蛋白与线粒体相关（图6f）。基因集富集分析（GSEA）证实，BP-PC处理的rOBs中Wnt信号通路上调，Hippo信号通路下调，氧化磷酸化相关通路活性增强，而ROS相关通路活性降低（图6g）。

图6. 定量蛋白质组学测序分析_{。（a）对照组和BP-PC组之间差异蛋白质组学分析的火山图；（b）对照组和BP-PC组中差异蛋白质的热图；（c）对照组和BP-PC组中差异蛋白质的亚细胞定位结果的饼图；（d，e）对照组和BP-PC组差异蛋白KEGG富集分析的条形图和气泡图；（f）对照组和BP-PC组的差异蛋白GO富集分析条形图；（g）Hippo、Wnt、氧化磷酸化和ROS富集状态的GSEA分析}

（7）BP-PC@GelMA通过Hippo和Wnt/β-连环蛋白信号通路的串扰调控线粒体稳态

基于KEGG定量蛋白质组学结果，评估不同BP和BP-PC处理下β-连环蛋白、YAP和TEAD的表达。BP-PC处理后，β-连环蛋白、YAP和TEAD表达显著增加（图7a）。为研究BP-PC@GelMA促进成骨机制，评估其对rOBs线粒体功能和形态影响。TEM观察发现，成骨诱导结合BP-PC@GelMA处理后，短棒状线粒体数量显著增加（图7d）。MitoTracker染色显示，BP-PC@GelMA处理后，rOBs线粒体呈分散网状，圆形线粒体比例增加（图7b）。定量分析表明，该组单个线粒体数量和分裂增加，网络数量减少（图7c）。进一步评估线粒体功能，结果显示BP-PC@GelMA组线粒体ATP输出最高，表明其增强了rOBs线粒体ATP生成（图7e）。此外，检测BP-PC@GelMA清除细胞内ROS能力，使用DCFH-DA评估ROS清除情况（图7f）。H₂O₂刺激模拟高ROS环境。使用JC-1和MitoSOX Deep Red评估线粒体膜电位和ROS生成。共定位结果显示，ROS诱导下，JC-1聚集体/单体比例显著降低（图7g），表明线粒体去极化和功能受损。为研究Hippo和Wnt信号通路串扰对线粒体稳态影响，使用拮抗剂LF3和IK-930。通过TMRM染色分析线粒体膜电位，发现LF3和IK-930处理后膜电位降低（图7h）。MitoTracker染色显示，处理后rOBs线粒体数量和荧光强度减少，形成稀疏网状结构，远离细胞核。Hoechst染色显示核荧光增强，提示潜在凋亡（图7i,j）。TEM观察到线粒体数量减少，多融合为拉长形态（图7k）。评估线粒体功能，结果显示ATP输出减少，降低rOBs中ATP生成（图7l）。

图7. BP-PC@GelMA对线粒体功能的影响_{。（a）β-连环蛋白、YAP、TEAD蛋白的表达及其定量分析；（b）通过激光共聚焦显微镜观察rOBs线粒体网络的形态学变化；（c）使用Kruskal-Wallis检验对个体线粒体计数、足迹和网络数量进行统计分析；（d）通过透射电镜观察rOBs线粒体形态；（e）测定不同处理下rOBs线粒体ATP的产生；（f）不同处理组的ROS染色；（g）JC-1和mtSOX深红色在不同处理组中的共定位染色；（h）不同组织的TMRM染色模式在各治疗组中的表现；（i）通过激光共聚焦显微镜观察线粒体动力学的变化；（j）使用Kruskal-Wallis检验对个体线粒体计数和网络数量进行统计学分析；（k）用LF3和IK-980处理后，通过TEM检查rOBs的线粒体形态；（l）测定不同处理下rOBs线粒体ATP的产生}

（8）BP-PC@GelMA通过增强线粒体动态依赖性成骨分化促进成骨

分析了rOBs中线粒体分裂和融合标志蛋白的表达模式，重点关注分裂相关Drp1、FIS1和MFF，以及融合相关Mfn1、Mfn2和OPA1。BP-PC@GelMA处理后，分裂相关基因Drp1和FIS1表达上调，FIS1表达量较NC组增加近四倍，MFF表达不变；融合标志物中Mfn2表达增加，OPA1减少，Mfn1无明显变化（图8a）。MitoTracker活细胞成像显示rOBs中线粒体分裂活跃（图8b）。推测BP-PC@GelMA可能通过调控线粒体动态影响分裂融合过程，发挥促成骨作用。

随后，研究敲除FIS1对BP-PC@GelMA处理的rOBs线粒体动态和成骨分化的影响。设计三条靶向FIS1的siRNA序列，选敲除效率最高的siFIS1-3（图8c）。FIS1干扰使线粒体形态从松散环形变紧密网状，长度和表面积显著增加（图8d,e）。同时，BP-PC@GelMA处理后，成骨标志物RUNX2、ALP和COL-1表达水平较NC组显著下降（图8f）。ALP染色和活性检测结果一致，表明FIS1下调减弱BP-PC@GelMA对rOBs成骨分化的促进作用（图8g）。因此，BP-PC@GelMA通过调控线粒体动态促进rOBs成骨分化。

图8. BP-PC@GelMA通过线粒体动力学促进成骨细胞分化_{。（a）处理7天后，通过PCR分析线粒体分裂（DRP1、FIS1、MFF）和融合标记（MFN1、MFN2、OPA1）的表达；（b）使用激光共聚焦显微镜，通过MitoTracker对rOB进行活细胞成像；（c）转染后24小时，通过PCR证实最有效的FIS1敲除序列；（d）通过共聚焦显微镜评估线粒体网络形态；（e）线粒体形态学的统计分析；（f）通过PCR评价各组间ALP、Runx2和Col-1的表达水平；（g）处理组（NC、siFIS1、siFIS1 + BP-PC）的相应ALP染色结果}

（9）BP-PC@GelMA作为线粒体质量控制（MQC）平台增强rOBs的分化

为了研究BP-PC@GelMA处理后rOBs中线粒体自噬水平的变化，通过Western blot分析量化了rOBs中线粒体自噬标志物LC3的表达水平。结果显示，BP-PC@GelMA处理组的LC3表达显著增加，表明该处理可能通过线粒体动态的变化增强了线粒体自噬（图9b,c）。LysoTracker Deep Red和MitoTracker Green FM的共定位为线粒体自噬的发生提供了有力证据，线粒体自噬是一种针对功能失调线粒体的重要细胞回收过程。在本研究中，这两种荧光染料被用于有效监测线粒体自噬的动态。值得注意的是，成骨细胞（OBs）中溶酶体活性显著增强，表现为LysoTracker Red荧光增加，同时GFP和LysoTracker Red阳性（黄色）区域显著增多，表明其积极参与线粒体自噬过程（图9a）。为了研究线粒体生物发生是否在线粒体数量增加中起作用，检测了rOBs中线粒体生物发生标志物的表达。结果显示，BP-PC@GelMA处理显著提高了NRF1的表达，而TFAM的表达显著降低。PGC-1α和NRF2的表达无明显变化。此外，BP@GelMA组的NRF1和PGC-1α水平显著增加。因此，推测BP纳米片可能是通过BP-PC@GelMA处理促进线粒体生物发生的关键成分（图9d）。

图9. BP-PC@GelMA通过MQC促进成骨细胞分化_{。（a）用LysoTracker}™ _{Red和MitoTracker™绿色FM进行共定位染色；（b）自噬相关蛋白（LC3）的Western印迹分析；（c）LC3表达的定量分析；（d）线粒体生物发生相关基因（NRF1、PGC-1α、NRF2、TFAM）的PCR分析}