研究背景：

针对上述问题，中国科学院大学李俊柏教授团队开发了一种针对胶质母细胞瘤（GBM）术后治疗的创新策略，构建了一种原位可注射的肽水凝胶系统，负载谷氨酰胺酶抑制剂CB-839和铜离子-肽配位纳米颗粒（Cu-His NPs）用于化学动力治疗（CDT）。该系统通过抑制谷氨酰胺代谢，降低肿瘤细胞内谷胱甘肽（GSH）水平，从而增强CDT的细胞毒性，同时诱导免疫原性细胞死亡（ICD）以激活免疫反应对抗肿瘤微环境。研究中使用的短肽水凝胶由Fmoc-YYK和Fmoc-YD自组装形成，具有优异的生物相容性和低免疫原性，能够填充术后空腔，物理限制肿瘤增殖，并通过调节降解实现药物的可控释放。实验结果表明，这种基于代谢重编程的联合治疗策略能够有效抑制GBM复发，并显著延长小鼠的总生存期，为GBM术后治疗提供了一种新的解决方案。该文章于2025年2月20日以《Immunostimulatory Hydrogel with Synergistic Blockage of Glutamine Metabolism and Chemodynamic Therapy for Postoperative Management of Glioblastoma》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202412507）。

研究示意图

（1）复合凝胶的合成与表征

本研究成功制备了负载Cu²⁺-肽纳米粒子（Cu-His NPs）和谷氨酰胺酶抑制剂CB-839的可注射肽水凝胶（组合凝胶）（图1A）。采用带正电荷的Fmoc-YYK和带负电荷的Fmoc-YD短肽分子，通过静电和π-π相互作用构建水凝胶支架。Cu-His NPs作为CDT发生器，通过组氨酸的咪唑基团与Cu²⁺配位，实现Cu²⁺在肿瘤微环境中的靶向释放。其SEM图像（图1B）和HRTEM图像（图1C）显示，Cu-His NPs为直径约40 nm的球形颗粒，且X射线光电子能谱（XPS）结果表明Cu²⁺与肽链内氮或氧原子形成配位键（图1D）。电子探针微分析（EPMA）进一步证实Cu²⁺在样品中的均匀分布（图1E）。Cu-His NPs和CB-839被封装于水凝胶中，扫描电子显微镜（SEM）图像显示其在纤维基质中均匀分散（图1F），且凝胶具有优异的注射性（图1G）。通过调整短肽分子组装，制备了与脑组织机械性能（1–2 kPa）相匹配的凝胶支架（图1H），并验证其生物相容性（图1I）。

图1 可注射水凝胶Combo Gel的特性。（A）Combo Gel制备的示意图；（B）Cu-His NPs的SEM图像；（C）Cu-His NPs的HRTEM图像；（D）Cu-His NPs和Fmoc-HH的XRD光谱，黑色箭头指示卫星峰的位置；（E）通过EPMA检测的Cu-His NPs的COMPO图像以及Cu、N元素分布图像；（F）Combo Gel的SEM图像；（G）通过22号针头将Combo Gel注入水中时，立即形成稳定的凝胶；（H）在37°C下，Fmoc-YD/YYK水凝胶在不同浓度下的幅度扫描曲线，实验重复了三次；（I）与阳性对照组相比，不同浓度的Fmoc-YD/YYK水凝胶的生物相容性，Fmoc-YD/YYK是指Fmoc-YD和Fmoc-YYK的1:1混合物，n=3

（2）水凝胶的体外抗肿瘤研究

Cu²⁺可与谷胱甘肽（GSH）发生氧化还原反应，生成Cu⁺和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。SEM分析显示，Cu-His NPs在与GSH反应5分钟后即失去球形完整性（图2A），表明反应动力学极快。这证实了Cu-His NPs在GSH存在下可降解并产生Cu⁺和GSSG。亚甲蓝（MB）的紫外吸收峰可用于检测羟基自由基（·OH）的生成。图2B显示，MB单独与H₂O₂反应或与Cu-His NPs和GSH混合时，4小时内紫外吸收峰变化较小；而当MB、H₂O₂、Cu-His NPs和GSH共同存在时，紫外吸收峰显著变化。这表明在GSH存在下，Cu²⁺与H₂O₂的类芬顿反应可高效产生·OH，从而靶向破坏肿瘤细胞。

图2 铜-组氨酸纳米颗粒的CDT机制，以及铜-组氨酸纳米颗粒和CB-839在体外的协同细胞毒性作用，以及水凝胶延长药物局部滞留和释放的能力。（A）在不同时间间隔下，铜-组氨酸纳米颗粒与GSH混合的SEM图像；（B）4小时反应后MB的降解证实了Cu⁺与H₂O₂之间的类芬顿反应，产生·OH，；（C）水凝胶中铜-组氨酸纳米颗粒和CB-839的累积释放曲线；（D）定量分析了水凝胶在小鼠大脑中的降解；（E）使用IVIS系统在特定时间点捕获老鼠大脑中水凝胶滞留的荧光图像，水凝胶用Cy5标记以进行追踪；（F）在24小时孵育后，评估了铜-组氨酸纳米颗粒和CB-839对GL261细胞系的抑制作用；（G）GL261细胞在暴露于铜-组氨酸纳米颗粒和CB-839 12小时后的活/死染色；（H）体外免疫串扰实验，每个分级的上清液与巨噬细胞共培养后，通过巨噬细胞检测IL-10分泌

Cu-His NPs在水凝胶中释放12小时后保持球形结构。Cu-His凝胶和CB-839凝胶浸泡于37°C的PBS中，5天后Cu-His NPs和CB-839释放量分别为57%和49%，20天后均达80%（图2C）。两种药物遵循零级释放动力学，表明水凝胶有效维持药物释放，延长滞留时间。药物释放速率与水凝胶体积损失同步，主要依赖于水凝胶降解。体内实验中，组合凝胶注入小鼠大脑后，通过IVIS系统监测Cy5标记的水凝胶信号（图2D, E），表明水凝胶在小鼠颅腔内迅速发生溶胶-凝胶转变，有效防止药物快速释放。

使用CCK-8试剂盒检测GL261胶质瘤细胞系在Cu-His NPs、CB-839单独或联合处理24小时后的细胞抑制率（图2F）。结果显示，联合治疗的细胞抑制率显著高于单药处理，10 µg/mL联合药物浓度下抑制率达27%。活/死细胞染色实验也证实了联合治疗的协同作用（图2G）。通过ELISA检测与GL261细胞系上清液共培养的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-10水平（图2H）。GL261细胞系上清液使巨噬细胞IL-10分泌增加约7倍，而CB-839处理后的GL261细胞系上清液诱导的IL-10水平显著降低，约为对照组的2倍（195.9 pg/mL），表明CB-839可重新编程肿瘤细胞中的谷氨酰胺代谢，减少巨噬细胞向M2表型的极化。

（3）细胞对Cu-His NPs的摄取以及通过协同治疗增强ROS生成和ICD效应

Cu-His NPs与GSH相互作用时发出紫色-红色荧光。为可视化Cu-His NPs的细胞内释放过程，使用Lysotracker Red标记溶酶体，并与标记有Cy5的Cu-His NPs（蓝色荧光）共定位（图3A）。孵育4小时后，Cu-His NPs的荧光几乎完全与溶酶体荧光重叠，显示黄色荧光，表明Cu-His NPs在胞吞后被隔离在溶酶体中，并部分逃逸到细胞质中。这证实了Cu-His NPs在细胞内可逃逸至溶酶体并释放药物，增强细胞内功效。其机制可能涉及组氨酸在溶酶体酸性环境中的质子化及其电荷变化，促进其与溶酶体膜的相互作用并实现逃逸。

过量的活性氧（ROS）会破坏肿瘤细胞的氧化还原平衡，诱导损伤或死亡，并触发免疫原性细胞死亡（ICD），释放损伤相关分子模式（DAMPs），激活抗原呈递细胞（如树突状细胞），从而刺激免疫系统。谷胱甘肽（GSH）对抵抗ROS引起的氧化应激至关重要，其水平与ROS呈负相关，GSH减少可能导致ROS积累和细胞死亡。该研究评估了不同配方对GL261细胞中GSH和GSSG水平的影响。结果显示，CB-839和Cu-His NPs单独处理可将GSH水平分别降低至19.0 µM和11.7 µM，而联合使用时，GSH水平进一步降低至8.2 µM（图3B）。随后，通过DCFH-DA染色监测治疗后肿瘤细胞的ROS产生，发现联合治疗组的ROS产生最高，荧光强度显著增加（图3D）。此外，与ICD相关的DAMPs，如表面钙网蛋白（CRT）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）和ATP，在细胞死亡过程中被释放。其中，ATP发出“find-me”信号，促进凋亡细胞的吞噬并触发抗肿瘤免疫反应；CRT作为“eat-me”信号，增强树突状细胞对凋亡细胞的吞噬，促进其成熟和功能；HMGB1则激活免疫信号通路并放大免疫反应。实验结果表明，联合治疗组肿瘤细胞中CRT、HMGB1和ATP的表达显著高于单药治疗组（图3C、E、F）。这表明联合治疗不仅通过促进胶质母细胞瘤（GBM）细胞释放DAMPs增强ICD，还显著放大了免疫反应，显示出持久抗肿瘤免疫的潜力，为癌症治疗提供了一种有希望的方法。

图3 细胞对Cu-His NPs的摄取以及通过协同治疗增强ROS生成和ICD效应。（A）2小时Cu-His NPs处理后GL261细胞的共聚焦显微镜图像，细胞核用DAPI染成蓝色，溶酶体用Lysotracker染成绿色，Cy5标记的Cu-His NPs呈红色荧光；（B）GBM细胞在24小时暴露于药物后细胞内GSH和GSSG水平的量化；（C）24小时治疗后GBM细胞内ATP水平的测量；（D）与药物孵育4小时后GBM细胞中的ROS染色荧光，用DAPI染成蓝色的细胞核和DCFH-DA染成绿色的ROS进行可视化；（E）药物处理后24小时GBM细胞释放CRT和（F）HMGB1，数据以平均值±标准差表示

（3）水凝胶的体内抗肿瘤研究

胶质母细胞瘤（GBM）的浸润性生长往往导致肿瘤边界不清晰，使得完全手术切除变得困难，并导致术后频繁复发。利用 Luc-GL261 细胞成功建立了原发 GBM 模型（图 4A,B；图 S20，支持信息）。选择肿瘤生长相似的鼠，并在接种 Luc-GL261 细胞后的第七天进行切除（图 4C）。小鼠分别接受 PBS、空白 Fmoc-YD/YYK 水凝胶（空白凝胶）、CB-839 水凝胶（CB-839 凝胶）、Cu-His NPs 水凝胶（Cu-His 凝胶）、自由 CB-839 和 Cu-His NPs（自由组合）或 CB-839 和 Cu-His NPs 水凝胶（组合凝胶）的治疗。通过监测生物发光信号追踪肿瘤复发，并在整个研究过程中记录小鼠的体重和存活率。接受 PBS 治疗的小鼠由于缺乏药物干预，经历了 GBM 的快速复发和随后的体重下降。自由组合组最初体重下降，可能是由于高剂量药物的快速释放。 与对照相比，CB-839 凝胶、Cu-His 凝胶和组合凝胶组体重变化最小，表明药物负载水凝胶能有效抑制 GBM 生长，且无明显毒副作用（图 4D）。选择生物发光强度在 10 6 和 10 7 之间的术后小鼠进行手术，并在第 8 天通过重新监测生物发光来确认手术的成功。 40 每隔 7 天监测肿瘤生物发光，直到 PBS 组的小鼠数量降至三个以下。组合凝胶组对 GBM 生长的抑制作用最为显著，在所有监测点中具有最低的荧光素酶强度（图 4E,G）。Kaplan-Meier 生存曲线显示，组合凝胶处理组的平均生存时间显著延长至 48 天，超过了 PBS 组的 27 天、空白凝胶组的 28 天、CB-839 凝胶组的 33 天、Cu-His 凝胶组的 35 天和自由组合组的 30 天（图 4F）。图 4H 显示了术后两周切除和原位给药的各种治疗方法的 H&E 染色脑组织切片。 与对照组相比，接受组合凝胶治疗的鼠表现出最小的肿瘤面积，表明其在预防肿瘤复发方面的优越疗效。总之，实验结果表明，结合谷氨酰胺代谢调节与 CDT 的组合凝胶治疗提供了卓越的治疗效果。它有效地抑制了 GBM 肿瘤的复发，延长了小鼠的中位生存期，并在体内诱导了全身抗肿瘤免疫。

图4 肿瘤切除后正位GBM模型中不同治疗方法的抗肿瘤复发疗效。（A）动物研究时间线示意图；（B）不同时间点正位Luc-GL261 GBM小鼠的T2加权MRI图像，实验重复了三次，肿瘤区域用橙色勾勒；（C）在第7天肿瘤植入后对小鼠进行正位Luc-GL261细胞的手术减瘤，肿瘤区域用橙色勾勒；（D）治疗后小鼠体重变化；（E）随时间变化的肿瘤生物发光，数据以平均值±标准误表示；（F）不同治疗方法后小鼠的生存曲线；（G）治疗组中Luc-GL261肿瘤生物发光信号的时序变化（部分数据），数据以平均值±标准误表示；（H）手术切除和原位药物治疗两周后，获取小鼠脑切片进行H&E染色组织学分析，实验重复了三次

（4）组合凝胶的体内肿瘤免疫效应研究

ROS诱导的细胞焦亡与DAMPs（如HMGB1和CRT）的产生密切相关。图5A显示，在手术切除后两周，组合凝胶组在大脑中CRT和HMGB1的荧光信号最强，尤其是HMGB1表达显著上调，促进了体内树突状细胞（DC）的成熟。相比之下，CB-839凝胶组DAMPs表达较低，表明Cu-His NPs在肿瘤细胞内产生的过量ROS是增强细胞焦亡的主要原因。肿瘤细胞与免疫细胞的代谢竞争影响抗肿瘤免疫治疗。肿瘤细胞对谷氨酰胺的高需求（“谷氨酰胺成瘾”）可通过GLS1抑制剂CB-839进行调节，从而减少肿瘤细胞对谷氨酰胺的消耗，为免疫细胞提供营养，增强其抗肿瘤功能。代谢重编程不仅抑制肿瘤细胞增殖，还影响免疫细胞功能，打破代谢循环与免疫微环境之间的通信网络。CB-839是一种GLS1抑制剂，可减少肿瘤细胞对谷氨酰胺的消耗，促进T细胞增殖和细胞因子产生，并影响巨噬细胞极化。流式细胞术分析显示，CB-839凝胶组和组合凝胶组的M1型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）比例显著增加，M1/M2 TAM比率分别达到23.6±1.0和23.1±1.5，是PBS组（5.0±0.4）的4.6倍（图5B-H）。这表明CB-839可诱导M2型TAM向M1型极化，重塑肿瘤免疫微环境。尽管组合凝胶组中M2 TAM数量变化不大，但其向更具免疫活性的表型转变是显著的。

组合凝胶组的活化树突状细胞（DC）百分比显著高于其他组，局部复发肿瘤组织中的DC细胞计数比PBS组增加了十二倍（图5E, I），表明免疫抑制性微环境有所改善。此外，组合凝胶处理的肿瘤中CD8⁺T细胞浸润显著增加（图5F, J），而Cu-His凝胶组也有类似效果（图5K）。相比之下，缺乏凝胶支架的Free Combo组效果减弱，表明组合凝胶的持续药物释放促进了T细胞浸润，重塑了肿瘤免疫微环境。

通过ELISA分析小鼠脑组织匀浆中的细胞因子，组合凝胶组表现出促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）水平升高，而抗炎细胞因子IL-10水平降低（图5L-O）。TNF-α和IFN-γ的表达分别比PBS组增加了1.4倍和2.4倍，而IL-6的表达是PBS组的2.4倍。这些结果表明，组合凝胶通过增加促炎细胞因子和抑制抗炎细胞因子，调节免疫细胞功能，增强T细胞浸润和TAM极化，引发免疫反应。

图5 激活治疗后使用不同药物的抗肿瘤免疫。（A）HMGB1和CRT的免疫荧光分析；（B）流式细胞术分析小鼠脑组织中切除后两周及原位给药的M1型TAMs；（C）M2型TAMs；（D）M1/M2 TAMs比例；（E）成熟DCs；（F）CD8 T细胞。流式细胞术量化各组脑组织中浸润的（G）M1型TAMs；（H）M2型TAMs；（I）成熟DCs；（J）CD8 T细胞；（K）小鼠肿瘤组织中CD8 T细胞浸润的免疫荧光分析；ELISA量化每组小鼠脑组织匀浆中的（L）TNF-α；（M）IFN-γ；（N）IL-6；（O）IL-10