针对上述问题，南京大学医学院附属医院周敏团队开发了一种响应式的载有rAAVs的微针贴片（AMNP），用于治疗内膜增生，实现血管周围的基因递送。这些补片主要由生物相容性明胶组成，尖端内嵌 rAAVs 用于血管周围基因递送，后层混合多巴胺用于粘附和响应。得益于多巴胺成分，补片不仅实现了与血管内膜的紧密附着，还延长了用于基因治疗的 rAAVs 的转染时间。通过 rAAVs 过表达 miR-145 可以调节平滑肌细胞的表型，从而缓解血管内膜增生。基于这些特点，在大鼠颈动脉模型中评估了 AMNP 的实用性，结果表明 AMNP 能够有效抑制或潜在逆转内膜增生的进展。这些结果表明，AMNP 很有希望成为治疗各种血管疾病的方法，因此具有广阔的临床应用前景。该文章于2024年11月15日以《Multifunctional Microneedle Patches for Perivascular Gene Delivery and Treatment of Vascular Intimal Hyperplasia》为题发表于《ACS Nano》（DOI: 10.1021/acsnano.4c09527）。

研究示意图

（1）微针贴片的制备和表征

图1a呈现了明胶微针贴片的制备过程：首先，含有rAAVs的明胶溶液被加入模具中，并通过离心作用富集到微针尖端；随后，加入掺杂不同浓度多巴胺（DA）的明胶溶液以形成背衬层；最后，经过冷冻干燥或空气干燥，制成完整的rAAVs负载微针贴片。图1b为氢核磁共振（H NMR）光谱分析图，揭示了多巴胺掺入明胶后不同浓度下的化学特征变化。其中，“Gel”代表纯明胶，“Gel-LDA”为低浓度多巴胺组，“Gel-HDA”为高浓度多巴胺组。图1c进一步通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，证实了多巴胺成功引入明胶材料中，特征峰的差异清晰展现了不同组分之间的化学结构变化。图1d展示了显微镜下不同干燥方法（空气干燥和冷冻干燥）制备的微针贴片外观对比。结果显示，冷冻干燥制备的微针针尖更尖锐且排列更规整，而多巴胺的加入并未明显影响针尖外形及孔隙结构。图1e通过扫描电子显微镜（SEM）观察到微针内部结构的差异：冷冻干燥的微针内部呈现多孔结构，而空气干燥的微针内部则较为致密。这表明冷冻干燥方法更适合病毒载体（rAAVs）的稳定保存。

图1 微针贴片的制备和表征。（a）制作过程示意图；（b）多巴胺（DA）和无（Gel）、低多巴胺（Gel-LDA）和高多巴胺（Gel-HDA）浓度明胶贴片的傅里叶变换红外光谱（FTIR）；（c）凝胶、凝胶-LDA、凝胶-HDA贴片和多巴胺的¹H NMR；（d）使用不同技术制作的微针的显微照片：（i, i', iii, iii'）空气干燥和（ii, ii', iv, iv'）冷冻干燥；（e）使用不同技术制作的微针的扫描电子显微镜（SEM）图像：（i, i', iii, iii'）空气干燥和（ii, ii', iv, iv'）冷冻干燥。比例尺：（d, i-iv）为250 μm，（d, i'-iv'）为100 μm，（e, i-iv）为40 μm，（e, i'-iv'）为8 μm

（2）MN的机械性能和粘附性测试

图2展示了明胶微针贴片的化学交联机制、界面黏附性能及相关力学测试结果。图2a呈现了明胶与多巴胺在高碘酸钠（NaIO₄）催化下进行交联反应的化学过程，揭示了明胶与多巴胺分子之间的化学交联机制；图2b展示了明胶-多巴胺（Gel-DA）水凝胶与组织之间的界面黏附机制，通过功能基团与组织表面的相互作用实现了较强的界面黏附性能。图2c为三组不同微针贴片（纯明胶Gel、低浓度多巴胺Gel-LDA、高浓度多巴胺Gel-HDA）的外观照片以及微针在不同受力（压缩）状态下的形态变化，结果显示所有微针尖端均在相似受力下发生弯曲或折断；图2d为微针贴片的受力-位移曲线图，反映了不同微针贴片在压缩条件下的机械强度及受力情况；图2e为柱状图，测试了不同浓度明胶对微针最大耐受压缩力的影响，发现明胶浓度增加可增强微针的机械强度，而多巴胺浓度对微针的机械强度影响不明显。图2f和g分别为搭接剪切测试（lap shear test）的示意图及典型的受力-位移曲线图，用于评估微针贴片与组织的剪切强度；图2h和i为拉伸测试（tensile test）的示意图及典型的受力-位移曲线图，用于评估微针贴片与组织界面的拉伸强度；图2j和k为180°剥离测试（peel test）的示意图及典型的受力-位移曲线图，用于评估微针贴片与组织间的剥离强度与黏附性能；图2l为剪切强度与拉伸强度的柱状图对比分析，表明含高浓度多巴胺（Gel-HDA）组的黏附强度远高于纯明胶（Gel）组，说明多巴胺显著增强了贴片的组织黏附性能；图2m为黏附能的柱状图比较，结果进一步证实高浓度多巴胺（Gel-HDA）能够明显提高微针贴片与组织界面的黏附能量。综上所述，这些结果表明多巴胺的加入虽然未明显提高微针本身的机械强度，但显著增强了微针贴片对组织的黏附性，使其更适合用于局部药物递送。

图2 微针的机械性能和粘附性测试。（a）合成过程示意图；（b）Gel-DA交联和粘附组织的原理示意图；（c）微针在机械强度测试前（i-i', i-ii'', iii-iii''）和测试后（i''-iii'''）的光学图像；（d）不同凝胶-DA比率的微针的轴向断裂力；（e）具有代表性的微针剥离力随时间变化的曲线；（f-m）测量三种不同贴片在猪主动脉膜上的粘附性能：（f, h, j）剪切、拉伸和剥离过程的示意图和照片；（g, i, k）相应的力-位移曲线；（l）剪切强度和拉伸强度统计；（m）界面韧性统计

（3）微针穿透和降解性能的表征

图3a为微针贴片应用于血管的示意图，展示了微针如何穿透血管外膜，实现病毒载体（rAAVs）的快速释放，同时背衬层则实现病毒载体的持续缓释。图3b是荧光显微镜下微针尖端装载荧光纳米颗粒（模拟病毒颗粒）的图像，证实了微针尖端成功负载药物。图3c为微针穿透琼脂凝胶后的光学和荧光显微镜图像，展示了清晰的穿刺孔和颗粒释放扩散情况，证实了微针的穿透和药物释放能力。图3d通过激光共聚焦显微镜（LSCM）拍摄了微针穿透离体猪动脉组织后荧光颗粒的组织内分布情况，说明微针具备有效穿透血管并深度释放药物的能力，释放深度可达约350 μm。图3e和f分别展示了三种成分的微针尖端（Gel、Gel-LDA、Gel-HDA）和背衬层在PBS中不同时间点的降解状态，结果显示多巴胺的加入显著延长了微针尖端的降解时间，且随着多巴胺浓度的升高，背衬层的降解速度显著降低。图3g为三种微针贴片材料在PBS中降解过程中重量损失的定量曲线图，明确展现了多巴胺浓度升高后降解速率显著降低的趋势。图3h进一步展示了高浓度多巴胺组（Gel-HDA）的背衬层在PBS中随时间推移的降解百分比变化曲线，说明Gel-HDA背衬层具有长效稳定性，有助于长期持续药物释放。以上图示结果证实了微针贴片良好的穿刺能力、药物释放性能，以及多巴胺加入显著延长降解时间，有助于更好的临床应用效果。

图3 微针穿透和降解性能的表征。（a）可溶解微针和在针尖释放rAAVs的示意图；（b）头端带有荧光纳米颗粒的微针贴片的宏观图像；（c）插入琼脂糖凝胶后针孔周围染色的荧光显微镜图像；（d）插入猪主动脉后微针孔的激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）图像；（e）微针在37°C下的溶解过程；（f）37°C下，贴片背层在PBS中的溶解过程；（g）背衬层的降解率（n=3，独立样本）。比例尺：（b）为100 μm，（c）为150 μm，（d）为100 μm，（e）为150 μm，（f）为500 μm

（4）微针贴片中 rAAV 的转染能力

图4a为微针贴片体外实验的总体流程示意图，展示了负载rAAV-GFP的微针贴片（AMNP）与动脉平滑肌细胞（VSMCs）共培养的过程，用于评估病毒颗粒（rAAVs）的转染效率和生物相容性。图4b通过激光共聚焦显微镜（LSCM）观察了不同处理组（空白组、直接加入rAAV-GFP组、微针贴片负载rAAV-GFP组）平滑肌细胞内绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，其中绿色荧光强度直接反映了病毒的基因转染效率，结果显示微针贴片的转染效果与直接加入病毒的转染效果类似，但微针制备过程略微降低了病毒活性。图4c-e为流式细胞术（FCM）对不同处理组VSMCs转染GFP的阳性率分析图：图4c为空白对照组细胞未见明显荧光；图4d为直接用病毒（rAAV-GFP）转染的细胞，GFP表达阳性率较高；图4e为微针贴片（rAAV-GFP patch）转染的VSMCs组，其转染率略低于直接病毒转染组。图4f为不同处理组细胞（血管平滑肌细胞和内皮细胞）的活性染色图像（细胞存活染色），其中空白组为阳性对照，Negative为阴性对照，Patch为实验组，结果显示微针贴片组的细胞存活状态良好，与空白组相似，表明微针贴片具有良好的细胞相容性。图4g为含病毒的明胶微针贴片对细胞（内皮细胞和VSMCs）的细胞毒性评价（OD值测定），结果显示各实验组的OD值与对照组差异不明显，进一步证实微针贴片对细胞无明显毒性，具有良好的生物相容性。图4h为不同处理组中GFP阳性细胞比例的统计结果柱状图，结果表明微针处理后病毒颗粒转染细胞的比例稍低于直接病毒组，说明冻干过程轻微降低了病毒载体的转染活性，但整体仍保持较高的转染效率。

图4 微针贴片中rAAV的转染能力。（a）rAAV和ASMCs共培养、观察和分析示意图；（b）GFP阳性ASMCs的激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）图像及DAPI和F-actin染色；（c-e）转染rAAVs的ASMCs的GFP阳性细胞图像和流式细胞术分析；（f）活细胞和死细胞染色；（g）ECs和ASMCs的CCK-8染色；（h）共培养后平均荧光强度分析；（i）共培养后GFP阳性细胞百分比分析。n=5，独立样本。比例尺：（b）为60 μm，（c-f）为100 μm

（5）rAAV-MN 贴片处理新内膜增生模型的结果

图5a为微针贴片治疗新生内膜增生的示意图，描述了通过球囊导管损伤血管内膜建立动物模型后，将微针贴片贴附于血管外膜，通过释放病毒载体（rAAVs）进行基因治疗，实现局部基因治疗的机制。图5b为活体荧光成像，显示不同处理方式（空白组、注射组、微针贴片组）的病毒转染效率差异。结果显示，微针贴片组在左侧颈动脉区域局部出现明显的绿色荧光，表明贴片给药具有显著的局部靶向性，而注射给药和空白组则无明显局部荧光表达。图5c为离体动脉的多种染色分析，包括HE染色（组织结构）、von Kossa染色（钙沉积）、弹力纤维染色（EVG）以及免疫荧光染色（α-SMA绿色、CD31红色），用于评估各组动脉组织病变的严重程度。结果显示，微针贴片组的内膜增生显著减少，内皮层完整性得到改善，验证了微针贴片治疗对抑制内膜增生的显著效果。图5d通过Western blot检测α-SMA和OPN蛋白的表达水平，明确微针贴片治疗组（Exp）的相关致病蛋白表达明显降低，进一步证实其对内膜增生的有效抑制作用。图5e为彩色多普勒超声（CDFI）图像，用于评估各组血管的通畅程度及血流速度。结果显示，贴片治疗组的血管管腔狭窄情况明显改善，表明治疗效果显著。图5f和g分别为骨桥蛋白（OPN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的定量统计图，评估血管内膜增生程度。结果显示，治疗组的OPN和α-SMA表达水平显著降低，表明微针贴片有效抑制了病理性内膜增生和平滑肌细胞的异常增殖。图5h为血管管腔狭窄率柱状图，显示微针贴片组的管腔狭窄率显著降低，表明治疗显著改善了血管狭窄情况。图5i为各组治疗后不同时间（0和1个月）的血流速度比较柱状图，证实贴片组的血流速度接近正常值，说明贴片治疗能够长期有效抑制内膜增生导致的血管狭窄。图5j和k分别为新生内膜面积和内膜/中膜面积比例的柱状图对比，结果显示微针贴片治疗后新生内膜面积明显减少，内膜/中膜面积比例显著降低，进一步验证了微针贴片治疗对内膜增生的良好抑制效果。

图5 rAAV-MN贴片处理新内膜增生模型的结果。（a）模型建立、处理和样本分析的实验方案示意图；（b）体内成像；（c）1个月后的Von Kossa、EVG和免疫荧光（IF）染色（绿色α-SMA/红色CD31/蓝色DAPI）；（d）增殖标志蛋白OPN和α-SMA蛋白的Western blot（WB）结果；（e）术后1个月的颈动脉多普勒血流成像；（f）蛋白质OPN的WB图像统计；（g）蛋白质α-SMA的WB图像统计；（h）通过qPCR测定的miR-145的表达；（i）术后即刻和术后1个月的血流速度统计；（j）内膜/中膜比率分析；（k）新内膜面积分析。n=4，独立样本。比例尺：100 μm