针对上述问题，四川医学科学院张瑞帆团队研究开发了一种针对SP/NK1R通路的新型靶向药物，通过丝素蛋白（SF）负载NK1R拮抗剂（CP99,994）构建纳米颗粒药物递送系统，并结合水凝胶用于眼部给药。结果表明，SF@CP@Gel是一种安全有效的抗炎修复药物，可调节Th17/Treg平衡，修复角结膜损伤，并显著缓解实验性DED的症状和体征。尽管已有研究探索纳米颗粒负载水凝胶在眼表给药中的应用，但本研究首次将SF纳米颗粒与NK1R拮抗剂相结合，构建长效药物递送系统，不仅调节Th17/Treg平衡，还促进眼表组织修复，为DED治疗提供了新的解决方案。该文章于2025年02月22日以《A Silk Fibroin Nanoparticle Hydrogel Loaded With NK1R Antagonist Has Synergistic Anti-Inflammatory and Reparative Effects on Dry Eye Disease》为题发表于《Advanced Science》上。（DOI: org/10.1002/advs.202404835）。

图1. SF@CP@Gel的研究示意图

（1）载药SF凝胶的制备和表征

首先，对SF@CP纳米系统进行表征，以评估其稳定的载药和释药性能。动态光散射（DLS）测得SF@CP水合直径为122 nm（图2A），透射电子显微镜（TEM）观察到其球形结构，尺寸约120 nm（图2B），与DLS结果一致。稳定性测试表明SF@CP在7天内保持145 nm，显示良好的体内循环与缓释能力（图2C）。电位滴定和紫外光谱（UV）分析证实CP成功负载（图2D,E），载药率和包封率分别为71.7%和15.2%（图2F）。SF@CP@Gel的物理化学性质进一步表征。扫描电镜（SEM）显示SF@CP@Gel呈现3D网络结构（图2G,H），表明水凝胶成功负载CP。物理图像显示其透明均匀，无明显颗粒沉淀（图2I）。核磁共振（NMR）分析表明SF@CP@Gel形成π–π相互作用（图2J）。流变学测试（图2K）表明凝胶主要呈液态，随剪切应变增加，储能模量（G′）下降，且无“凝胶点”，说明其流动性较强。凝胶在PBS中快速吸水膨胀，最大膨胀率达800%（图2M）。释药曲线（图2N）显示，6 h释放60%，12 h达平衡（80%），并可维持25 h。结果表明，SF@CP@Gel具备稳定载药、控制释放及良好流变特性，有望用于药物递送。

图2. 载药纳米系统的特征及载药SF水凝胶的物理化学性质。（A）SF@CP的DLS直径；（B）SF@CP的TEM图像；（C）SF@CP在7天内的尺寸稳定性；（D）SF、CP和SF@CP的Zeta电位；（E）SF、CP和SF@CP的紫外光谱分析；（F）SF@CP的载药效率及CP的包封效率；（G）凝胶的SEM图像；（H）凝胶的SEM图像；（I）SF@CP@Gel的实物图像；（J）Gel、SF@Gel和SF@CP@Gel的质子核磁共振（¹H-NMR）谱图；（K）凝胶、SF@Gel和SF@CP@Gel的流变性能测试；取15 mL样品，使用微红外流变仪进行振荡速率扫描（25 °C ± 0.2 °C，γ = 0%–1000%，f = 1 Hz）；（L）凝胶、SF@Gel和SF@CP@Gel的粘度-时间关系曲线；固定温度25 °C，应变γ = 1%，频率f = 1 Hz；（M）凝胶、SF@Gel和SF@CP@Gel的溶胀比；（N）药物释放行为

（2）载药 SF 水凝胶的体外细胞毒性

新药开发的首要条件是无害或低细胞毒性。该团队使用CCK-8实验评估了载药材料的生物相容性，并检测了人角膜上皮细胞（HCECs）的活性。如图3A所示，空白组与SF组的光密度（OD）值几乎相同，表明SF不会影响细胞活力。此外，进一步研究了凝胶材料对细胞活力的影响。结果显示，空白组和凝胶组的细胞随时间稳步增殖，且不同浓度SF@CP@Gel浸提液处理的细胞活力均未显著下降，与空白组相比无明显差异。这表明纳米载体和凝胶材料均具有良好的安全性。

图3. 不同载药生物材料的体外细胞毒性、抗氧化和细胞迁移测试。（A）细胞活力评价；（B）DCFH-DA标记的细胞ROS图像；（C）使用DCFH-DA监测ROS生成的半定量分析；（D）使用流式细胞仪监测ROS的生成；（E）使用流式细胞仪监测ROS生成的半定量分析；（F）细胞划痕实验；（G）划痕面积统计

（3）有效的抗氧化和促细胞迁移能力

该研究利用生长良好的原代HCECs评估了不同药物亚组的抗氧化能力和迁移能力。首先，通过检测活性氧（ROS）含量评估细胞氧化损伤程度（图3B）。二氯荧光素（DCF）探针与ROS结合后，在共聚焦显微镜下呈现绿色荧光，荧光强度越高，ROS含量越高，细胞核则以DAPI标记。从共聚焦图像可见，CP、SF@CP和SF@CP@Gel（CP浓度5 µg/mL）处理组的ROS荧光水平较对照组显著降低，统计结果见图3C。其中，SF@CP@Gel组ROS含量显著低于其他两组（p < 0.001）。此外，流式细胞术通过FITC通道检测绿色荧光，以定量评估细胞氧化损伤程度（图3D），其半定量结果见图3E。结果表明，三种处理组的ROS水平均显著低于对照组，且虽无显著性差异，但呈下降趋势。通过划痕实验进一步探讨SF凝胶载药对细胞迁移能力的影响（图3F），并在12 h和24 h时分别进行定量分析（图3G,H）。结果显示，12 h时各处理组细胞迁移率均有所增加，但差异无统计学意义；24 h时，所有处理组细胞迁移率均显著高于对照组，且三组间无显著性差异。

（4）治疗效果的体内评估

实验小鼠药物给药时间表见图4A。通过临床指标（如泪液分泌量和角膜荧光素染色（CFS））评估CP组、SF@CP和SF@CP@Gel治疗组在干眼症小鼠模型中的疗效。图4B显示，正常组和模型组的泪液分泌量分别为0.62 mm和0.25 mm，表明干眼症模型成功构建。治疗14天后，SF@CP和SF@CP@Gel组的棉线长度接近0.39 mm。通过CFS评估角膜上皮损伤，图4C显示角膜上皮缺损为黄色绿色区域。14天后，SF@CP@Gel组CFS评分比DED组降低93.2%，优于其他组。ELISA检测Treg细胞功能，图4D显示DED模型组与正常组在IL-10、IL-35和TGF-β1水平上差异显著（p < 0.0001）。SF@CP@Gel组的IL-10水平是DED组的5.01倍（p < 0.001），且IL-35和TGF-β1水平显著上调。HE染色分析显示药物在体内具有生物安全性。

图4. 不同给药系统的给药时间线及体内治疗效果。（A）治疗实验时间线；（B）对照组、DED模型组、CP治疗组、SF@CP治疗组和SF@CP@Gel治疗组的泪液分泌情况及统计分析；（C）不同组别的角膜荧光素染色评分（CFS）及统计分析：对照组、DED模型组、CP治疗组、SF@CP治疗组和SF@CP@Gel治疗组；（D）用ELISA法测定结膜组织中IL-10、IL-35和TGF-β1的含量

（5）治疗效果的组织学评估

为评估药物治疗后干眼小鼠的损伤组织恢复情况，收集眼球、角膜和结膜样本进行组织学检查。HE染色（图5A）显示，干眼模型组角膜上皮细胞排列紊乱、数量增多，基质层胶原纤维肿胀且与上皮层交织，结膜严重损伤。治疗后，各治疗组角膜上皮细胞数量减少，胶原纤维排列逐渐整齐，结膜细胞排列恢复。SF@CP@Gel组角膜形态接近正常组，效果优于CP和SF@CP组。Masson染色（图5B）显示，模型组角膜胶原纤维交织肿胀，治疗组胶原纤维排列恢复，肿胀消失。TUNEL实验（图5C）显示，模型组角膜上皮细胞凋亡显著高于正常组（p < 0.0001）。治疗后，CP、SF@CP和SF@CP@Gel组凋亡细胞百分比分别减少26.29%、63.98%和87.43%，表明SF@CP@Gel具有显著的抗氧化和组织修复效果。

图5.不同药物递送系统的组织学分析。（A）角膜的HE染色；（B）角膜的Masson染色；（C）角膜的TUNEL染色和定量

（6）SF@CP@Gel 调控 SP/NK1R 信号通路

为确认SF@CP@Gel的疗效，对治疗前后角膜和结膜中的SP和NK1R进行DAPI复合染色（蓝色为阴性，黄色为阳性），并用荧光显微镜观察（图6）。通过ImageJ定量SP（图6A）和NK1R（图6B）的综合光密度（IOD）。正常组与模型组的SP和NK1R IOD差异显著（均p < 0.0001），证实干眼模型成功构建。图6显示，各治疗组与模型组相比，SP和NK1R在角膜和结膜中的下调均显著。SF@CP@Gel治疗后，干眼小鼠角膜中SP的IOD减少43.74%（p < 0.0001），结膜中减少48.30%（p < 0.0001）。角膜中NK1R的IOD减少46.12%（p < 0.0001），结膜中减少44.00%（p < 0.0001）。CP和SF@CP治疗也显著降低了SP和NK1R水平，但SF@CP@Gel效果最佳，使其表达接近正常组水平。

图6. 角膜和结膜中 SP 和 NK1R 表达的免疫组织化学分析。（A）角膜的SP免疫组化染色和定量统计；（B）角膜的NK1R免疫组化染色和定量统计

（7）SF@CP@Gel能有效调节Th17/Treg细胞平衡

通过流式细胞术分析了角膜、结膜和淋巴结中Th17和Treg细胞的百分比（图7）。所有治疗组中，角膜、结膜和淋巴结中CD4[+]IL-17[+] T细胞的频率显著低于干眼小鼠模型（p < 0.0001）。SF@CP@Gel在DED模型中的治疗效果最佳，角膜、结膜和淋巴结中分别减少了73.56%、64.01%和55.94%。在角膜和结膜中（图 7A，B），SF@CP@Gel组的CD4[+] IL-17[+] T细胞频率显著低于CP和SF@CP治疗组（p < 0.001）。在淋巴结中（图 7C），SF@CP@Gel组Th17细胞的减少也显著高于CP组（p < 0.01）。Treg细胞分析显示，SF@CP@Gel治疗后，角膜、结膜和淋巴结中的CD25[+] Foxp3[+] T细胞频率显著增加。在结膜中，SF@CP@Gel组Treg细胞的上调显著高于CP和SF@CP组（p < 0.0001）。尽管角膜和淋巴结中三组间无显著差异，但仍显示上调趋势。通过实时PCR分析了IL-17A和Foxp3转录因子的mRNA表达（图7D，E）。角膜中，SF@CP@Gel组IL-17A mRNA的表达显著低于其他组（p < 0.0001）。结膜中，SF@CP@Gel治疗组IL-17A mRNA表达比DED模型组低55.04%（p < 0.001）。在角膜和结膜中，SF@CP@Gel组Foxp3 mRNA的表达显著高于其他组，表现出强烈的Treg细胞功能标志Foxp3的上调。

图7. 流式细胞术分析Th17和Treg细胞，以及PCR分析不同组织中的IL-17A和Foxp3。（A）在DED诱导后第14天，流式细胞术评估角膜中IL-17A⁺Th17和Foxp3⁺Treg细胞的频率；（B）流式细胞术检测小鼠结膜中IL-17A⁺Th17和Foxp3⁺Treg细胞的频率；（C）流式细胞术检测小鼠淋巴结中IL-17A⁺Th17和Foxp3⁺Treg细胞的频率；（D）角膜中IL-17A和Foxp3的RNA水平；（E）结膜中IL-17A和Foxp3的RNA水平