慢性牙周炎是一种全球流行的口腔疾病，由多种致病因素协同作用引起。牙龈卟啉单胞菌等细菌是导致过度炎症的主要因素之一，导致局部活性氧水平升高和M1巨噬细胞过度表达。因此，通过抗菌作用、清除活性氧和抑制M1巨噬细胞表达来调节牙周微环境可能是治疗慢性牙周炎的有效方法。深共晶溶剂（DESs）由至少一个氢键受体（HBA）和一个氢键供体（HBD）组成，当这些化合物按特定的摩尔比混合时，主要通过氢键形成共晶混合物。DES具有增强的生物降解性和生物相容性，以及加速药物溶解性和渗透性的优越能力，从而提高了许多药物的生物利用度。DES的固有特性有可能解决传统水凝胶在扩散性和渗透性方面的局限性，特别是对于低水溶性分子。因此，含有DES生物功能的共晶凝胶在炎症性疾病中的应用具有极大的研究潜力，但这一领域的研究尚未完全展开。

针对上述问题，四川大学李建树和徐心源团队利用氯化胆碱 ([Ch]Cl) 和甘露糖 (Mannose) 制备ChCl/M DES，然后引入溶菌酶纤维 (Fly) 和没食子酸 (GA)，通过氢键和亲水/疏水相互作用自组装成可注射的共晶凝胶，将其应用于慢性牙周炎的治疗，并且从细胞膜渗透性的角度深入探究了小分子药物生物利用度提高的根本原因。没食子酸（GA）是一种具有良好抗氧化、清除自由基和抗炎特性的小分子；然而，它的亲水性和强极性给其跨膜吸收带来了巨大的障碍，而DES能够显著提升GA的细胞渗透性，从而克服这一障碍。甘露糖作为一种来源丰富且经济实用的糖类，近年来因其免疫调节功能被广泛研究，可有效抑制炎症并对自体免疫相关疾病产生积极作用，因此可被选作HBD。同时，选择氯化胆碱ChCl作为HBA，其生物降解性、无毒性和成本效益会进一步提高DES的适用性。该文章于2024年11月19日以《Self-Assembled Eutectogel with Cell Permeation and Multiple Anti-Inflammatory Abilities for Treating Chronic Periodontitis》为题发表于《 Advanced Materials 》（DOI：10.1002/adma.202412866）。

研究示意图 自组装共晶水凝胶的示意图及其在慢性牙周炎治疗中的原理

(1) 共晶水凝胶的制备与表征

该研究团队通过自组装溶菌酶纤维（FLy）、没食子酸（GA）和ChCl/M共溶剂（10 wt%水溶液）制备了自组装共晶水凝胶（Eutectogel）（图1a）。在低pH和高温条件下，溶菌酶水解形成多肽，进一步组装为纤维状结构。通过圆二色谱（CD）、原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）确认了FLy的形成（图1b,c）。CD光谱显示，溶菌酶的α-螺旋比例从0.252降至0.172，β-折叠比例则由0.4增加至0.512，表明其发生了纤维化变化。FLy、GA和ChCl/M DES的混合物在40°C超声处理后，冷却至室温形成不流动的共晶水凝胶（图1d）。冷冻扫描电镜图像（图1e）显示，水凝胶呈均匀孔隙结构，孔径范围为3至6μm。FT-IR光谱（图1f）进一步证实了水凝胶中氢键的存在。CD光谱分析（图1g）表明，DES10-FLy30-GA30水凝胶在217-218nm处呈现负峰，而在195-198nm处有强正峰，显示出β-折叠构象的增强。这表明共晶水凝胶的形成是通过FLy的自组装和与ChCl/M DES的相互作用驱动的，其中氢键稳定肽链的结构。流变实验（图1i）表明，随着FLy含量的增加，水凝胶的粘度和弹性模量（G'）增强，证实了FLy在水凝胶网络中起到关键作用。注射力测试（图1j）表明，所有样品的注射力低于3N，适合临床应用。水凝胶与生物组织的附着力测试（图1k）也显示，FLy含量的增加提升了其附着力，增强了药效的发挥。

图1. （a）共聚物形成的示意图。（b）溶菌酶蛋白（Ly）和溶菌酶纤维（FLy）的圆二色性图像。（c）Ly 和 FLy 的 AFM（Height）和 TEM 图像。（d）共聚物的光学照片。（e）孔径约为 3 ~ 6 μm 的共析层（DES10-FLy30-GA30）的 Cyro-SEM 图像。（f）ChCl/M DES、FLy、GA 和共析共酯（DES10-FLy30-GA30）的 FTIR 光谱。（g）圆二色图像和（h）FLy、DES10-FLy30、DES10-GA30、FLy30-GA30、DES10-FLy30-GA30 的 CD pro 定量数据。（i）G′ 和 |η| 共凝胶随速度变化的流变测试。（j）共凝胶注射力试验。（k）共凝胶与猪皮肤的粘附试验

(2) 共晶水凝胶的抗菌性能

该研究团队通过平板涂布法评估了自组装共晶水凝胶对大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的抗菌效果。结果显示，含没食子酸（GA）的水凝胶表现出接近100%的抗菌效果，而不含GA的DES10-FLy30水凝胶对大肠杆菌的杀菌活性不到50%，对金黄色葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌的活性约为80%（图2a）。尽管溶菌酶纤维（FLy）具有一定抗菌作用，但效果不足以满足临床需求。扫描电镜（SEM）图像（图2b）显示，GA处理后的细菌细胞膜出现裂纹和溶解，细胞破裂明显。相比之下，DES10-FLy30组细菌细胞膜仅呈现褶皱形态，未见穿孔。这表明GA能有效破坏细菌膜的完整性，导致细胞死亡，而FLy则通过增强的疏水β-折叠结构促进膜破裂。在为期三天的抗菌试验中，含GA水凝胶组表现出持续的抗菌效果，未见细菌生长，显示出优异的长期抗菌性能（图2d）。DES10-FLy30组则在第一天出现菌落，但随后的两天未再生长，表明FLy在短期内也能有效抑制细菌繁殖。综上所述，GA的释放是共晶水凝胶长期抗菌效果的关键，而FLy则在短期内通过膜破坏机制抑制细菌生长。

图2. （a）共凝胶与 10⁶ CFU mL⁻¹ 的菌液以 1:1 的体积比共培养 24 h 后的杀菌活性。（b）细菌与不同样品共培养后的 SEM 图像。（c）共凝胶与 10⁶ CFU mL⁻¹ 牙龈假单胞菌（P. gingivalis）以 1:1 体积比共培养 72 h 的实验示意图。（d）琼脂板在 24、48 和 72 h 的实验照片

(3) 共晶凝胶的活性氧清除和免疫调节作用

该团队通过DCFH-DA和DHE探针标记细胞内的·OH和O₂⁻，评估水凝胶的ROS清除能力。结果显示，H₂O₂刺激后，·OH和O₂⁻的荧光强度显著增加，表明ROS产生，而对照组几乎没有荧光信号。含没食子酸（GA）的水凝胶显著降低了ROS的荧光强度，DES10-FLy30-GA30组效果最为显著，表明GA通过氢原子转移（HAT）机制有效清除ROS。此外，使用ChCl/MDES作为溶剂的DES10-FLy30-GA30组比水溶液中的FLy30-GA30更强地清除ROS，可能与ChCl/M DES增强了细胞膜通透性和GA生物利用度有关。在免疫调节实验中，LPS刺激后，巨噬细胞主要呈M1型（CD86标记），而M2型（CD206标记）几乎没有荧光。治疗后，含GA水凝胶显著降低了CD86的荧光强度，并提高了CD206的荧光强度。流式细胞术分析显示，GA处理组CD86阳性细胞比例下降约65%，CD206阳性细胞比例上升，表明GA促进了M1向M2的转化，有助于减轻慢性牙周炎的炎症反应。实时PCR检测结果显示，GA组中促炎因子（iNOS、TNF-α）表达显著降低，抗炎因子（IL-10、Arg-1）表达显著上升。与DES10-GA30组相比，DES10-FLy30-GA30组表现出更强的免疫调节效果，这可能与ChCl/M DES增强了GA在细胞内的渗透性和作用。综上所述，DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶通过增强GA的细胞渗透性，显著促进巨噬细胞的M1向M2转化，抑制促炎因子的表达，增强抗炎因子的产生，为慢性牙周炎的治疗提供了新的潜力。

图3. （a）不同样品共培养的 H₂O₂ 刺激的 Raw 264.7 巨噬细胞的亮场和荧光图像；DCFH-DA 染色的绿色荧光表示细胞中的 ·OH，DHE 染色的红色荧光表示细胞中的 O₂⁻。（b）使用 ImageJ 计算不同样品的清除细胞内 ROS 的定量数据。（c）LPS 刺激的 Raw 264.7 巨噬细胞与不同样品共培养的荧光图像；DAPI 染色蓝色荧光指示细胞核，红色荧光指示细胞内 CD86/CD206。（d）使用 ImageJ 计算不同样品 CD86 和 CD206 的定量数据。（e）各组巨噬细胞处理后表达 CD86 和 CD206 的流式细胞术结果；利用 CD86（红色，PE 通道）和 CD206（绿色，APC 通道）抗体分别特异性标记 M1 样巨噬细胞和 M2 样巨噬细胞。（f）不同处理组 Raw 264.7 细胞炎症相关因子和抗炎症相关因子的 qPCR 结果

(4) GA的细胞内摄取与免疫调节

图4a显示，H₂O-GA30组在培养1小时后，巨噬细胞内的Cy5荧光强度明显低于其他组。流式细胞术分析（图4b）表明，H₂O-GA30组中仅2.17%的细胞为Cy5-GA阳性，而DES10-GA30组增至36.9%。在FLy的作用下，Cy5-GA阳性细胞比例进一步提高至44.9%。随着培养时间延长（图4c），在6小时后，H₂O-GA30组细胞内GA的比例为10.5%，而DES10-GA30和DES10-FLy30-GA30组分别上升至72.9%和80.6%，显示出ChCl/M DES和FLy的协同作用，显著促进了GA的内化。这一效果的提升可能与ChCl/M DES对细胞膜的渗透性增强有关。ChCl/M DES通过释放阳离子、阴离子和甘露糖，与细胞膜结合，部分改变膜的结构，促进GA的细胞内吸收。与H₂O-GA30组相比，使用ChCl/M DES的DES10-GA30和DES10-FLy30-GA30组表现出更高的GA内化效率。FLy通过在细胞膜表面聚集并与膜蛋白结合，进一步促进GA的持续释放和局部浓度增加，这通过渗透压效应进一步促进了GA的内化。综上所述，ChCl/M DES和FLy的联合应用显著提高了GA的内化效率，不仅增强了GA的抗炎作用，也为慢性炎症相关疾病提供了新的治疗策略。

图4. （a）Raw 264.7 巨噬细胞与不同样品共培养的荧光图像，DAPI 染色蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示细胞内 cy5-GA。（b）1 h 和（c）6 h 后含 cy5-GA 的巨噬细胞流式细胞术结果。（d）含有 FLy 和 ChCl/M DES 的共凝胶有效内化 GA 免疫调节的示意图

(5) 抑制牙槽骨吸收：DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶的疗效

该研究团队采用微CT技术评估了治疗慢性牙周炎的效果。对照组（未治疗的结扎组）表现出明显的牙槽骨吸收，特别是在第一和第二磨牙的唇侧和腭侧。两周后的治疗结果显示，DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶组表现出最佳疗效，显著改善了骨吸收，CEJ-ABC距离减少了75.5%，骨矿密度（BMD）和骨体积（BV/TV）分别提高了166.44%和743.20%。与市售牙周炎药物Periocline相比，DES10-FLy30-GA30的效果更为突出。此外，DES10-FLy30组的治疗效果较差，表明GA是治疗牙周炎的关键成分。通过TRAP染色分析，DES10-FLy30-GA30组几乎未见破骨细胞，进一步验证了其抑制骨吸收的作用。总的来说，DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶为慢性牙周炎提供了一个有效的治疗新策略。

图5. （a）SD 大鼠牙周组织治疗综合时间表示意图。（b）从显微 CT 结果评估牙槽骨丢失。治疗 2 周后上颌牙槽骨颊侧和腭侧具有代表性的二维矢状面 X 线图像和三维构造图像。（c）CEJ-ABC 平均线距、骨密度（BMD）、骨量/总积（BV/TV）的统计分析。（d）采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色对上颌第一、第二磨牙周围牙间区进行组织学检查。黑色箭头表示 TRAP 阳性（染红）细胞

(6) 体内抗炎作用

如图6所示，H&E染色结果显示，未治疗的对照组出现严重的骨吸收和牙槽骨破坏，而DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶组显著缩短了CEJ-ABC距离，接近健康组，显示出其治疗牙周炎的潜力。健康组的牙龈组织结构规则，胶原纤维有序，而对照组则表现出明显的炎性细胞浸润和上皮层增厚，提示严重牙周炎。相比之下，DES10-FLy30-GA30组炎性细胞浸润减少，组织损伤较轻，牙槽突起侵蚀得到改善。Masson染色结果显示，治疗组胶原纤维排列整齐，提示促进牙周修复。虽然DES10-GA30和FLy30-GA30组也有所改善，但DES10-FLy30组效果最佳，表明GA与FLy的协同作用更强。免疫染色分析表明，对照组巨噬细胞主要呈促炎性M1表型，而DES10-FLy30-GA30组则促进巨噬细胞向抗炎性M2表型转化，显示出卓越的免疫调节作用。qPCR分析结果进一步证实，DES10-FLy30-GA30组显著降低了M1促炎因子，增加了M2抗炎因子，显示出更强的抗炎效果。综上，DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶在抗炎、修复和免疫调节方面具有显著效果，展现出广泛的临床应用潜力。

图6. （a）H&E 染色和（b）MASSON 染色对上第一和第二磨牙周围的牙间区进行组织学检查。（a）中的黑色箭头表示 CEJ-ABC 的横截面距离。（c）大鼠第一磨牙和第二磨牙之间牙龈组织的免疫荧光图像，DAPI 染色的蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示细胞内 CD86/CD206。（d）共聚凝胶处理牙周组织炎症相关细胞因子和抗炎症相关细胞因子的 qPCR 结果

(7) 慢性牙周炎的口腔微生物群

图7展示了不同组别（健康组、对照组、Periocline组、DES10-FLy30-GA30组）口腔微生物群的差异。通过16S rRNA基因测序和多种分析方法，我们揭示了不同组别间的显著差异。热图结果显示，对照组含有大量致病菌，如变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota），这些致病菌导致了口腔微生态的严重失衡。而DES10-FLy30-GA30组的微生物群落结构与健康组更为相似，显示其对抗致病菌的能力。DES10-FLy30-GA30组的物种丰富度接近健康组，表明它在恢复口腔微生态方面具有显著作用。Venn图显示，DES10-FLy30-GA30组与健康组共享998个ASVs，而Periocline组仅共享329个ASVs，说明DES10-FLy30-GA30在恢复健康口腔微生态方面更具优势。主成分分析和多维尺度分析也表明，DES10-FLy30-GA30组与健康组的微生物群相似性更高。进一步分析发现，DES10-FLy30-GA30组显著降低了致病菌的含量，恢复了口腔健康。总的来说，DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶不仅改善了口腔微生物群的平衡，还通过去除致病菌群，为牙周炎治疗提供了新的有效方案。

图7. （a）健康组、对照组（+）组、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组口腔微生物群热图。（b）健康组、对照组（+）组、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组口腔微生物群相对丰度条形图。（c）健康组、对照组（+）组、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组口腔微生物群的维恩图。（d、e）健康组、对照组（+）、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组口腔微生物群的 PCoA 和 NMDS 分析。（f）健康组、对照组（+）、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组口腔微生物群的 Shannon、Simpson、Pielou's 和 Chao_1 丰富度指数。（g）LEfSe 分析鉴定健康组、对照组（+）、Periocline 组和 DES10-FLy30-GA30 组的优势菌

研究小结：

该团队利用ChCl/MDES的高生物相容性及其促进溶解和渗透的特性，成功通过一锅法制备了注射型DES10-FLy30-GA30共晶水凝胶。这种共晶水凝胶的卓越性能得益于其核心成分--ChCl/M DES和大分子肽FLy，它们有效增强了小分子药物GA的溶解度和细胞渗透性，从而显著提高了GA的生物利用度。GA的独特性质使其能够穿透细菌的周质膜，清除ROS并诱导巨噬细胞从M1型向M2型极化，展现了出色的广谱抗菌性能。动物实验结果显示，DES10-FLy30-GA30共晶凝胶在慢性牙周炎模型中显著抑制了牙槽骨吸收，CEJ-ABC值从1298 ± 21.42 μm降低至980 ± 4.22 μm。同时，共晶凝胶还有效减弱了破骨细胞活性并减轻了炎症反应。此外，通过16S RNA检测，该共晶凝胶在根除致病菌的同时，还成功恢复了口腔微生物群的平衡，维护了口腔微环境的稳态。这一创新性的共晶水凝胶不仅提升了药物的生物利用率，还为抗菌和抗炎治疗提供了一种简便且高效的平台，具有广泛的应用前景，尤其在炎症性疾病的管理中展示了巨大潜力。