关节软骨位于活动骨骼的末端，其自愈能力有限，且一旦发生退行性病变，常常导致骨关节炎（OA）的发作。OA的关键病理过程之一是软骨组织的退化，特别是在软骨缺损的部位，治疗这些缺损带来了巨大的挑战。近年来，间充质干细胞（MSCs）靶向再生已被认为是软骨组织工程的重要途径之一，且被认为是治疗OA的最有效策略之一。然而，基于干细胞的治疗也存在局限性，例如，干细胞在定向诱导软骨形成方面的能力较弱，以及软骨修复过程中的机械强度降低。此外，软骨组织固有的无血管和无神经特性使得关节软骨缺损的治疗更加复杂。为了解决这些问题，基因疗法，尤其是利用功能性RNA和生物材料辅助框架，已成为软骨再生中的一种前景广阔的策略。微小RNA（miRNA）因其能够精准调控靶基因及其相关途径的空间和时间表达，已被发现对软骨发育和软骨形成具有重要作用。特别是在OA患者的软骨祖细胞/干细胞（CPCs）中，miR140-5p水平的显著降低与OA的发生密切相关。因此，miR140-5p的靶向递送和表达调控成为一种潜在的治疗策略，为软骨再生提供了新的研究方向。

针对上述问题，北京协和医院翁习生团队开发并制备了一种自愈水凝胶（miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB），用于控制软骨再生的关键调节因子miR140-5p的释放。水凝胶通过紫外线辐射交联，由胺化透明质酸和改性光敏剂（NB）组成。为了提高支架的结构完整性并增强基因传递效率，矿化丝素蛋白蛋白和负载miR140-5p的MON-PEI纳米颗粒被添加到水凝胶中。该自愈合水凝胶的设计，采用透明质酸（HA-NB）与改性透明质酸（AHA）之间的动态希夫碱键连接，这种特殊的结构赋予了水凝胶出色的自修复能力。每当水凝胶受到外力破坏，破损的部分可以在接触后迅速通过席夫碱键的重新形成恢复原状，避免了水凝胶在体内应用时的损坏。这一独特特性使得该水凝胶在生物医学领域，尤其是关节治疗中，具有极高的应用潜力。此外，基于透明质酸的自愈水凝胶因其卓越的润滑性能，特别适合用于关节内的治疗，能够有效减轻软骨损伤带来的临床挑战。因此，这种基因激活水凝胶在治疗关节软骨缺损方面具有重要的临床应用潜力。该文章于2024年11月05日以《Self-Healing Hyaluronic Acid-based Hydrogel with miRNA140-5p Loaded MON-PEI Nanoparticles for Chondrocyte Regeneration: Schiff Base Self-AssemblyApproach》为题发表于《 Bioactive Materials 》（DOI：10.1002/advs.20240）。

(1) CaP@mSF和MON-PEI纳米颗粒的特性

mSF 和 CaP@mSF 的红外光谱（图 1A）显示，mSF 在 1650 cm^-1处的吸收峰对应于酰胺 I 带 C=O 的拉伸振动吸收峰。将磷酸钙涂覆在 mSF 表面后，酰胺 I 带 C=O 的吸收峰出现了向低波长的位移（1634 cm^-1），表明 Ca²⁺ 与微纤维的羧基之间发生了相互作用。在 XRD 图谱（图 1B）中，mSF 在20.7°处的宽峰属于 β-折叠晶区，表明 mSF 存在有序的内部结构。经过 7 天的生物矿化，CaP@mSF的吸收峰出现在29.64°、31.64°、35.98°、39.64°和47.02°，证明了磷酸钙在 mSF 表面存在。在热重曲线（图 1C）中，mSF 和 CaP@mSF 都在约 100°C 时失去约 8.333% 的水分。扣除水分后，mSF 的残留比例为 30.451%，CaP@mSF 的残留比例为 37.3%，表明所制备的 CaP@mSF 中磷酸钙的比例约为 6.849%。微纤维丝浸泡在矿化介质中，并在矿化过程中使用磁力搅拌防止 mSF 凝结。经过 7 天矿化，钙磷完全涂覆在 mSF 样品表面。扫描电子显微镜（图 1D）结果显示，未矿化的 mSF 在第 0 天呈现光滑的微纤维结构；在第 4 天 mSF 表面出现了磷酸钙晶体；经过 7 天矿化后，mSF 表面几乎完全被磷酸钙覆盖。图 1E 展示了所制备的介孔有机硅（MON）材料的透射电子显微镜图像，呈现出类似雪花的多孔分支结构，这归因于加入了BTES，提升了其接枝聚乙烯亚胺（PEI）和载入 SiRNA 的能力。在 MON-COOH 的制备过程中，介孔硅粒子的粒径明显增大，可能是由于 MON-COOH 粒子间通过静电吸附聚集了羧基和氨基。经过 PEI 接枝后，MON-PEI 的粒径恢复到与 MON 和 MON-NH₂ 类似的水平，表明 MON-COOH 中的羧基和 PEI 接枝减弱了粒子间的静电相互作用。最终，MON-PEI 的 Zeta 电位为 34.1 ± 0.21 mV，为 SiRNA 装载提供了有利条件（图 1H、F、G ）。图 1I 中 MON-PEI/miR140-5p 复合物的琼脂糖凝胶电泳结果。随着 N/P 比例的增加，MON-PEI 与 miR140-5p 形成稳定复合物，证明其在基因递送中的有效性。N/P 比例超过 20 时，miR140-5p 迁移受限，表明成功包裹 RNA，从而提高了载荷稳定性。

图1. A) mSF 和 CaP@mSF 的红外光谱图；B) mSF 和 CaP@mSF 的 X 射线衍射谱图；C) mSF 和 CaP@mSF 的热重曲线；D) mSF 在 0d、4d 和 7d 的矿化度；E) MON 纳米颗粒的TEM；F) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的平均粒径；G) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的 zeta 电位；H) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的粒度分布图；I) MON-PEI 纳米粒子与 miR140-5p 的凝胶电泳

(2) 生物聚合物粘合剂和CaP@mSF-HA-NB水凝胶的评价

在红外光谱（图 2A）中，HA-NB 和 AHA 在约 1650 cm⁻¹ 处显示出酰胺 I 带 C=O 的吸收峰，表明成功修饰。核磁共振（图 2B）进一步确认了HA-NB中苯环氢的存在，证明了NB基团成功接枝到透明质酸上。紫外光谱（图 2C）显示，HA-NB在350 nm和307 nm处具有吸收峰，支持了NB结构中的大π键的存在，并证明了UV照射后NB的结构发生了变化，形成了能够与AHA氨基反应的醛基结构。图 2E 展示了水凝胶的自愈合能力。将水凝胶切开后，绿色染料加入水凝胶中，当两个切面接触时，它们会迅速恢复结合，显示出自愈合特性。此外，水凝胶在水环境中自然膨胀并逐渐降解，释放含miR140-5p的MON-PEI纳米颗粒，释放过程主要通过分子扩散完成。扫描电子显微镜（图 2D）显示，水凝胶的孔隙尺寸和密度随着HA-NB浓度的增加而变化。随着HA-NB浓度的增加，水凝胶的交联度增强，导致孔隙尺寸减小，孔隙密度增加。图 2F、G显示了UV固化水凝胶的弹性模量（G'）和粘性模量（G''）随时间和频率的变化，所有组别均保持G' > G''，表明水凝胶在适当条件下保持稳定的凝胶状态。随着HA-NB浓度的增加，G'显著增强，表明水凝胶的力学强度有所提升。

图2. A) AHA、HA-NB 和 HA 的红外光谱；B) AHA、HA-NB 和 HA 的核磁共振谱；C) AHA、HA-NB 和 HA 的紫外光谱图；D) 不同比例 HA-NB/AHA 水凝胶的扫描电镜；E) CaP@mSFHA-NB 水凝胶的自愈合能力；F、G）：不同组水凝胶的流变特性

(3) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB表现出高生物相容性并促进hBMSCs的软骨分化

通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测，hBMSC在与不同浓度的CaP@mSF-HA-NB提取物共同培养5天后，发现10%、25%和50%的提取物显著促进了细胞增殖（图3A）。然而，在100%浓度下，细胞增殖与0%组无显著差异，表明该材料具有良好的生物相容性。为了验证CaP@mSF-HA-NB对miR140-5p的传递效果，使用定量实时PCR检测miR140-5p模拟物在hBMSC中的转染效率。结果显示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组的miR140-5p表达显著高于单独处理miR140-5p组（图3B2），说明该复合材料能够更有效地稳定miR140-5p，增强其在体外的稳定性。进一步使用RNA提取、RT-PCR和转录组测序（RNA-Seq）检测四组细胞（NC模拟物、miR140-5p模拟物、miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB、NC-CaP@mSF-HA-NB）的软骨生成基因表达情况。结果表明，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组的软骨生成基因COL2A1和ADAMTS5的表达显著高于其他组（图3B3），提示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组能有效诱导hBMSC向软骨分化。RNA-Seq分析显示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组与NC组之间存在显著的基因表达差异。KEGG分析揭示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组富集了与类风湿关节炎、PI3K-Akt、MAPK、TGF-β等与软骨生成和骨生成相关的信号通路（图3E）。GSEA分析也显示，在与关节炎相关的通路中，差异表达基因（DEGs）呈现显著富集（图3F）。此外，DEGs列表中出现了多种特异性表达于软骨细胞的基因，进一步支持了miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组能够显著促进hBMSC的软骨生成趋势（图3G）。

图3. A) CCK-8结果描述了不同浓度的CaP@mSF-HA-NB提取物与细胞培养基混合培养5天后hBMSCs的增殖情况；B)细胞转染培养48 h后，NC、miR140-5p、NC-CaP@mSF-HA-NB、miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB四组细胞中miR140-5p、ADAMTS5、COL2A1的表达情况；C) RNA-Seq热图显示NC、miR140-5p、NC-CaP@mSF-HA-NB和miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB四组的deg；D) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC组转录组数据散点图；E) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC组DEGs的KEGG分类；F) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC中DisGeNET富集分析的GSEA结果；G)骨性关节炎膝关节DEGs列表（C0409959, DisGeNET） miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC

(4) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗促进OA细胞模型软骨细胞增殖

图4A和图4B在IL-1β诱导的关节炎模型中，C28/I2细胞的增殖明显受到抑制。相比于对照组，IL-1β组的细胞增殖显著下降。然而，经过miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗后，C28/I2细胞的增殖率恢复至正常水平。使用流式细胞术对细胞凋亡进行评估（图4C，图4D），结果显示，与对照组相比，IL-1β组细胞凋亡显著增加。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗后，细胞凋亡显著减少，几乎完全逆转了IL-1β引起的凋亡效应。这些结果与EdU染色法的检测结果一致，表明miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB促进了OA细胞的增殖并减缓了其凋亡。流式细胞术还进行了细胞周期分析，评估了C28/I2细胞在不同周期阶段的分布情况。IL-1β组的G1期细胞比例显著高于对照组，且S期细胞比例明显降低，提示IL-1β组细胞存在G1期停滞现象。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗后，IL-1β诱导的细胞周期变化得到了有效逆转（图4E，图4F）。这些结果表明，IL-1β诱导的细胞周期停滞可能与OA模型中的细胞老化有关，导致RNA和蛋白质合成减缓，从而抑制细胞增殖。miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗能够逆转C28/I2细胞的衰老，恢复其增殖能力。综上所述，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗显著改善了OA细胞模型中的细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化，展示了其在骨关节炎治疗中的潜力。

图4. A) 用 EdU 染色法评估五组对 C28/I2 增殖的影响：新一代细胞通过EdU（绿色），DAPI 染色的细胞核为蓝色，EdU（绿色）和 DAPI（蓝色）的合并图显示重叠；B) 增殖细胞的统计结果的统计结果；C) 流式细胞术结果显示五个实验组 C28/I2 细胞的细胞凋亡情况；D)细胞凋亡的统计结果；E) 流式细胞术分析描述了五个实验组中 C28/I2 细胞的细胞周期分布；F)流式细胞仪中细胞周期分布的统计结果

(5) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗减轻OA细胞模型软骨细胞炎症

该研究采用ELISA检测了IL-6、TNF-α和NO在不同实验组细胞培养上清液中的浓度。结果表明，IL-1β组的IL-6、TNF-α和NO水平显著高于空白组；而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组则显示出显著降低的炎症因子水平，尤其是IL-6、TNF-α和NO，与IL-1β组相比，差异显著（图5A）。这些结果表明，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB能够有效减少IL-6、TNF-α和NO的浓度，从而缓解炎症反应。过量的活性氧（ROS）可以诱导软骨细胞凋亡，激活炎症因子的产生，并加速关节软骨的降解。为了量化不同实验组中的ROS水平，研究通过流式细胞术对包括空白组、IL-1β组、IL-1β + CaP@mSF-HA-NB组、IL-1β + miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组以及IL-1β + NC-CaP@mSF-HA-NB组在内的各组进行了ROS水平检测。结果显示，IL-1β 组的ROS水平为7.64%，显著高于空白组的1.27%。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治疗组的ROS水平降至1.73%，接近空白组水平，表明该处理能够显著降低ROS水平，减轻氧化损伤，从而有效缓解炎症反应（图5B和图5C）。综合来看，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB通过减少炎症因子（如IL-6、TNF-α和NO）的水平以及降低ROS的积累，显著改善了关节炎细胞模型中的炎症反应，并有望为治疗骨关节炎提供新的治疗思路。

图5. A) 5个实验组C28/I2细胞中IL - 6、NO和TNF - α的ELISA结果；B) 5个实验组C28/I2细胞中ROS水平的流式细胞术结果；C)流式细胞术中ROS水平的统计结果

(6) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB用于兔胫骨关节软骨缺损的体内治疗

CT图像（图6A1,A2,B1,B2,C1,C2）和宏观照片（图6A3,B3,C3）显示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组在软骨缺损的修复上表现出显著的效果。Safranin O-Fast Green染色为关节软骨和下软骨骨结构提供了可视化的表现。通过染色图像可以看到（图6A4,A5,B3,B4,C3,C4），随着从左至右处理组的变化，代表软骨的红色区域逐渐增多，显示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB显著促进了软骨修复。

图6. A1、A2)空白组家兔股骨髁软骨缺损的显微CT扫描，B1、B2) NC-CaP@mSF-HA-NB组家兔股骨髁软骨缺损的显微CT扫描，C1、C2) miR140-5p-CaP@mSFHA-NB组家兔股骨髁软骨缺损的显微CT扫描，A3)空白组家兔股骨髁缺损大体形态，B3) NC-CaP@mSF-HA-NB组家兔股骨髁缺损大体形态，C3) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组兔股骨髁缺损大体形态。A4,A5)空白组家兔股骨髁软骨缺损的Safranin O-Fast绿色染色，B3,B4) NC-CaP@mSF-HA-NB组家兔股骨髁软骨缺损的Safranin O-Fast绿色染色，C3,C4) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB组家兔股骨髁软骨缺损的Safranin O-Fast绿色染色。

研究小结：

研究团队设计了一种通过紫外线交联形成的自愈水凝胶，并通过席夫碱反应实现原位组装。为了进一步提升治疗效果，研究人员将用于递送miR140-5p的介孔有机硅-聚乙烯亚胺（MON-PEI）纳米颗粒加入到水凝胶中。在该设计中，水凝胶成功构建了一个强大的交联3D聚合物网络，创造出一个模拟天然组织细胞外基质的环境，为细胞提供了良好的支持。更为重要的是，纳米颗粒内封装的miR140-5p能够在适当的时机被释放，并通过精准调控特定的生物途径，促进软骨修复和再生。该自愈水凝胶不仅能够高效装载miRNA，还由于其独特的自修复特性，能更好地填充和修复关节软骨缺损部位。随着水凝胶逐步降解，纳米颗粒中的miR140-5p被成功释放并转染至目标细胞，促进软骨的修复和再生。此外，该水凝胶还加入了矿化丝素蛋白，显著提升了其力学性能，使其在关节腔中的应用更具优势。经过多重验证，这种自愈水凝胶不仅表现出极佳的生物兼容性和修复能力，还为基因治疗提供了一种创新且高效的递送平台。