牙周炎是全球最普遍和最普遍的疾病之一，占成年人的发病率为 30%，严重损害患者的咀嚼能力，甚至对患者的自尊和社会或职业功能造成负面影响。牙周炎是由牙菌斑中的微生物侵入引发的，可逐渐破坏牙齿的支撑组织，通常会导致牙周袋的形成、牙槽骨的吸收，并最终导致牙齿脱落。目前，牙周炎治疗的临床治疗主要集中在预防疾病进展，包括机械疗法、使用抗生素对抗生物膜以及服用抗炎药。其受到根除深牙周袋细菌效率低、半衰期短的临时刺激和副作用的限制。更重要的是，这些策略无法解决牙周炎不可逆的牙槽骨吸收问题。牙槽骨的吸收加剧了牙齿松动，并产生了继发性咬合创伤，从而影响患者的咀嚼功能，导致牙周炎的高度复发。因此，在牙周炎的预防和治疗中非常需要抑制牙槽骨吸收和促进骨再生，这仍然是一个重大挑战。

针对上述问题，来自中国医学科学院冯祖建、王伟伟和天津医科大学口腔医院邓嘉胤团队开发出一种仿生糖肽水凝胶（MH/GRW凝胶），该水凝胶通过精准调节牙周炎治疗中的破骨细胞和成骨作用，实现了骨骼稳态的重建。这一创新成果为牙周炎的治疗提供了新的策略，有望在临床应用中取得显著疗效。该文章以“Bioinspired Glycopeptide Hydrogel Reestablishing Bone Homeostasis through Mediating Osteoclasts and Osteogenesis in Periodontitis Treatment”为题于2024年10月14日发表在《ACS Nano》上（DOI：10.1021/acsnano.4c05677）。

方案. 仿生 MH/GRW 凝胶示意图，具有持续的抗菌活性，能够恢复牙周炎的骨稳态

（1） GRW凝胶的制备与表征

葡甘露聚糖（GM）是一种多糖，具有生物相容性好、固有生物活性和易于功能化等优点，广泛应用于药物递送、组织工程和伤口愈合等领域。通过高碘酸钠氧化GM并结合赖氨酸修饰的RADA肽，成功制备出RADA偶联的GM水凝胶（GRWgel）。该水凝胶具有β-片层结构的纳米纤维微结构，由RADA自组装形成，且内部多孔网络结构相互连通，RADA 肽的圆二色（CD）光谱在 220.5nm 处有最大椭圆率，在 202.5nm 处有最小值，这归因于其特征性的 β - 折叠结构，RADA 和 W9 混合溶液的 CD 光谱与 RADA 肽相似，表明添加 W9 没有改变 RADA 固有的二级结构。（图1a-c）。流变学测试表明，GM-RADA水凝胶（GRWgel）处于类固体状态，具有可调节的机械性能(图1d)。此外，GRWgel展现出优异的自愈合能力，能够在剪切力下保持结构完整性(图1e, f)。体外降解实验显示，GRWgel在人工唾液中可持续降解（图1g）。综上所述，GRWgel作为一种新型水凝胶，具有纳米纤维微结构、可调节机械性能、良好注射性、自愈合能力和生物降解性等优点，为药物递送和组织工程提供了潜在支架，具有广阔的应用前景。

图1. GRW凝胶的制备和理化性质.（a） 不同样品的代表性 TEM 图像。比例尺，100 nm。（b） RADA、W9 和 RADA/W9 溶液的 CD 谱图 （0.1 mg/mL）。（c） 冻干 RADA 和 GRW 凝胶的代表性 SEM 图像.比例尺，100 μm。（d） GRW凝胶的流变分析在 0.1 至 100 rad/s 的频率扫描下具有不同的 GM-CHO 含量 （GM-CHO：RADA/W9 = w：w）。（e） GRW凝胶的应变扫描在 37 °C 时具有不同的 GM-CHO 含量。（f） GRW凝胶的自修复特性。（g） GRW凝胶的降解体外 （n = 3）

（2）MH/GRWgel的细胞相容性

本研究采用人牙龈上皮细胞、小鼠成纤维细胞和大鼠骨髓间充质干细胞作为模型细胞进行评估。活/死染色结果显示，大部分细胞在培养3天后存活（图2a）。CCK8试验进一步证实，这些细胞在肽和纳米纤维水凝胶中的活性高于对照组，表明其有利于细胞增殖（图2b-d）。Transwell试验显示，RADA组和W9组的骨髓间充质干细胞迁移能力显著增强，而GRWgel组迁移的细胞数量最多，这可能归因于糖肽聚合物的存在，为细胞粘附、通讯和迁移提供了合适的微环境（图2e）。

图2.GRW凝胶表现出良好的细胞相容性并增强 BMSCs 的迁移。（a） 孵育 3 天后 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的活/死染色。比例尺，100 μm。（B-D）不同处理后 CCK-8 测定测定 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的增殖能力 （n = 3）。（e） BMSCs 迁移测定和迁移细胞数定量分析 （n = 3） 的代表性图像

（3）GRWgel抑制破骨细胞形成

破骨细胞是在生长和重塑过程中侵蚀骨骼的特殊细胞，是源自单核-巨噬细胞前体细胞的多核细胞。RANKL 是一种信号因子，对破骨细胞生成至关重要且必要，并参与骨吸收。将高RANKL亲和力的W9肽引入GM-RADA水凝胶（GRWgel），旨在干扰破骨细胞形成中RANKL与RANK的结合，抑制牙周炎骨吸收。通过TRAP染色评估，发现W9能显著减少RANKL诱导的破骨细胞成熟数量（图3a）。进一步实验显示，W9下调了破骨细胞成熟相关的转录因子c-Fos和NFATc1的表达（图3b），以及破骨细胞特异性功能分子如MMP9、TRAP和CTSK的编码基因和蛋白表达（图3c,d）。这些结果表明W9通过阻断RANKL和RANK结合的下游通路来抑制破骨细胞成熟。分子对接模拟和ITC实验证实，W9与RANKL具有高结合亲和力，通过多个氢键稳定结合，W9 与 RANKL 结合以屏蔽 RANKL/RANK 交互，而不是直接与此交互竞争。（图3e-f），并干扰RANK细胞外域C端部分的结合，特别是CRD3环区域，从而屏蔽RANKL/RANK相互作用。在有无W9的情况下，RANKL和RANK的结合常数差异显著，进一步支持W9干扰RANKL和RANK结合并影响下游信号传导的结论。因此，将W9引入GR水凝胶中显示出对RANKL的特异性结合亲和力，有效抑制破骨细胞成熟，为牙周炎等骨骼相关疾病的治疗提供了新策略。

图3.GRW凝胶通过与 RANKL 的特异性结合在体外抑制破骨细胞形成。（a） TRAP 阳性多核破骨细胞的图像（破骨细胞：红色箭头）。比例尺，200 μm。（b） Western blot 破骨细胞相关蛋白的表达 （n = 3）。（c） qPCR 破骨细胞相关基因的表达 （n = 3）。（d） 不同样品的 TRAP 活性 （n = 3）。（e） GRW凝胶和RANKL的结合通过分子刚性对接。（f） GRW凝胶和 RANKL之间的亲和力 由 ITC 分析

（4）GRWgel诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化

破骨细胞驱动的骨吸收和成骨细胞驱动的骨形成之间的平衡被破坏会促进牙槽骨丢失。除了抑制破骨细胞的形成外，成骨干预被认为是促进牙槽骨修复所必需的。成骨细胞源自骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化，对骨再生起关键作用。实验通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现，GRWgel因其糖肽成分及纤维状多孔结构，能促进BMSCs粘附和伸展（图4a）。进一步研究结果显示，GRWgel组在碱性磷酸酶（ALP）和茜素红S（ARS）染色中展现出最高的成骨效率和密集的钙结节分布，表明其增强了成骨作用（图4b, c）。此外，W9肽也被报道具有潜在成骨活性，可通过激活特定信号通路增加RUNX2表达水平。为进一步评估GRWgel对BMSCs成骨分化的影响，通过qPCR和Western blot检测成骨相关基因和蛋白表达水平。结果显示，GRWgel组显著上调了BMP2、RUNX2、ALP和COL-I的表达（图4d, e），表明GRWgel能增强BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，有利于牙周炎治疗中的骨再生。

图4. GRW凝胶支持有效的细胞粘附和增强的体外成骨。（a） 培养 24 小时的 BMSCs 的形态。（b） 第 7 天捕获的 ALP 染色图像。（c） 骨诱导 21 天后的 ARS 染色。（d） 第 7 天 qPCR 测定的成骨相关基因表达 （n = 3）。（e） 第 7 天 BMP2 和 RUNX2 的蛋白质印迹分析和定量数据 （n = 3）

（5）MH/GRWgel的抗菌活性

生物膜形成是牙周炎的引发因素，包括各种细菌菌落的侵袭和增殖。为了赋予GRW凝胶长期的抗菌性能，研究者将临床上用作抗菌剂的MH物质封装在凝胶中（图5a, b）。实验显示，MH从GRW凝胶中持续释放，有效延长了其在牙周组织的半衰期。通过菌落计数和死活染色等方法评估，MH/GRW凝胶对血链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌等关键牙周致病菌表现出显著的抗菌活性（图5c）。特别是，该凝胶不仅能消除浮游状态的细菌，还能有效去除生物膜内的细菌。这归因于MH的释放和GRW凝胶中RADA肽的精氨酸残基的原位抗菌作用，后者能破坏细菌细胞壁，使MH更易渗透到细菌内部（图5d, e）。因此，MH/GRW凝胶通过结合这两种机制，显示出强大的抗菌功效，有望成为牙周炎治疗中消除细菌感染的有效手段。

图5. MH/GRW凝胶显示出有效的抗菌活性和去除生物膜的能力。（a）水凝胶及其抗菌特性的示意图。（b）GRW凝胶的 MH累积释放 (n = 3）。（c）血链球菌、核镰刀菌和牙龈卟啉假单胞菌菌落的数量 （n = 3）。（d）MH/GRW 凝胶的长期抗菌作用体外 （n = 3）。（e）牙龈卟啉单胞菌的活/死染色。比例尺，100 μm。（f）牙龈卟啉单胞菌的 SEM 图像。（g）牙龈卟啉单胞菌生物膜的活/死染色

图6.MH/GRW凝胶在体内显示出抗菌活性和抑制牙槽骨吸收。（a） 结扎线诱导的牙周炎模型和治疗过程的示意图。（b） MH/GRW凝胶的抗菌效果治疗 1 周后体内 （n = 5）。（c） 治疗 4 周后 M2 周围上颌牙槽骨的代表性 micro-CT 图像。（d） M2 的 CEJ 和 ABC 之间距离的定量分析结果 （n = 5）。（例如）定量分析骨骼相关参数：显微 CT 图像中的 BV/TV （e）、Tb.Th （f） 和 Tb.Sp （g） （n = 5）

（6）MH/GRWgel在体内促进牙槽骨再生

为揭示牙槽骨形态，研究采用了H&E染色和马松三色染色分析上颌样本。结果显示（图7a），健康组牙槽骨吸收轻微，而对照组高度显著降低，缺乏牙间乳头，为牙周炎症状。相比之下，MH/GRW凝胶组牙槽骨高度较高，上皮组织正常，牙间乳头特征明显。马松三色染色显示（图7b），MH/GRW凝胶治疗后，再生牙槽骨多为成熟组织，胶原沉积有序且致密。免疫荧光染色（图7c, d）和qPCR分析（图7e）进一步表明，MH/GRW凝胶组中RUNX2阳性细胞多，TRAP阳性细胞少，成骨基因表达高，破骨细胞基因表达低。这些结果表明，MH/GRW凝胶具有抗菌效果，能抑制破骨细胞活性，促进成骨分化，有效抑制牙槽骨丧失，为牙周炎提供了一种有效的治疗方法。

图7.MH/GRW凝胶抑制牙槽骨吸收，促进体内牙槽骨再生。（a） 上颌标本的 H&E 染色。比例尺，500 μm。黑色箭头表示牙槽骨。红色箭头表示根。（b） 上颌牙槽骨的 Masson 三色染色。比例尺，500 μm。（c） RUNX2 （红色） 免疫荧光染色和统计分析 （n = 3） 的代表性图像。（d） TRAP IHC 和统计分析的代表性图像 （n = 3）。（e） 牙槽骨中成骨 （ALP、RUNX2 和 CoL-I） 和破骨细胞 （TRAP） 基因表达的 qPCR 分析 （n = 3）

研究小结：

该研究制备了一种仿生糖肽水凝胶，将抗菌活性与抑制牙槽骨吸收和促进牙槽骨再生协同结合以治疗牙周炎。该凝胶具有制造简单、类似 ECM 的纳米纤维和多孔微观结构、自修复能力和良好的注射性等优点。MH 的原位释放抑制了牙周袋中牙菌斑生物膜的形成，减轻了牙周炎。更重要的是，W9 的引入使水凝胶能够特异性结合 RANKL 并抑制 RANKL 诱导的破骨细胞生成。此外，W9 能够促进 BMSCs 的成骨分化，增加 ALP 活性促进成骨。因此，MH/GRW凝胶成功阻止大鼠牙周炎进一步病变，抑制牙槽骨吸收，促进牙槽骨再生。这项研究强调了通过介导骨破骨细胞生成和成骨治疗牙周炎重建骨稳态的重要性，设想这种糖肽水凝胶具有巨大的潜力，可以成为临床治疗牙周炎的可行制剂。