糖尿伤口愈合延迟是由于组织收缩力降低造成的，高血糖和缺氧微环境导致细胞存活和迁移受到严重抑制，这影响了伤口愈合。对温度变化作出反应的温度敏感水凝胶已显示出通过机械收缩促进伤口愈合的前景。然而，已报道的水凝胶敷料在湿润损伤部位通常反应缓慢、机械收缩不足，从而限制了其疗效。同时，由于高度交联的网络和有限的生物活性，这些材料通常无法在维持细胞活力和促进细胞迁移的同时对伤口提供快速、变化的牵引力。此外，人间充质干细胞 (hMSC) 分泌各种细胞因子和趋化因子，可减少细胞凋亡、恢复受损的组织弹性并刺激组织和血管再生。与 MSC 相比，通过细胞出芽和质膜融合产生的外泌体表现出更好的稳定性、更低的免疫排斥和更容易内化到受体细胞中，使其在临床应用中前景广阔。但由于外泌体体积小、易扩散，在伤口或表皮上的有效停留时间有限，因此设计合适的载体对外泌体的持续递送具有重要意义。

针对上述问题，华南理工大学边黎明/张琨雨教授团队开发了一种具有强大组织黏附力的新型自收缩活性核-壳微凝胶组装体（SMART-EXO），以加速糖尿病伤口愈合。由于丰富的氢和动态配位键，SMART-EXO 敷料对受损组织表现出强大的可逆粘附性。此外，核壳微凝胶成分和动态配位键提供中等刚度、可定制的自收缩和相互连接的多孔结构。SMART-EXO 敷料触发的原位自收缩可实现主动、可调节的伤口收缩，激活皮肤中的机械转导并促进最佳的成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化、胶原蛋白合成和血管生成。同时，SMART-EXO 的触发收缩有助于有效装载和按需释放生物活性外泌体，有助于糖尿病小鼠的再上皮化和伤口微环境调节。RNA 测序结果揭示了与机械传感和外泌体调节相关的关键信号通路的激活，突出了生物力学和生化机制的结合。这些发现强调了 SMART-EXO 是一种多功能、适应性强的解决方案，可应对糖尿病伤口护理的复杂挑战。该文章于2024年7月23日以《In Situ Triggered Self-Contraction Bioactive Microgel Assembly Accelerates Diabetic Skin Wound Healing by Activating Mechanotransduction and Biochemical Pathway》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202406434）。

（1）具有强组织粘附性的自收缩微凝胶组装体的制造和表征（SMART）

该研究团队首先使用N-异丙基丙烯酰胺 (NIPAM) 和丙烯酸 (AAC) 单体，通过改进的沉降聚合制备了 NIPAM-co-AAC 微凝胶（图 1A、B）。透射电子显微镜 (TEM) 图像显示微凝胶具有核壳结构（图 1C），动态光散射 (DLS) 显示其流体动力学直径为 1.83 µm（图 1D）。微凝胶尺寸随温度升高而缩小，在约 37°C 的低临界溶解温度 (LCST) 时显著下降（图 1E），归因于聚合物链的亲水和疏水基团共存。加入EDC后，微凝胶进一步自组装形成自收缩微凝胶组装体 (SMA)。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，单分散微凝胶逐渐聚集形成几十微米大小的结构，最终形成大的微凝胶组装体（图 1F）。48小时后，获得圆盘状多孔结构，由紧密堆积的微凝胶构成的三维结构（图 1G，H）。

随后，为增强组织粘附性，在 SMA 中引入聚丙烯酸 (PAA) 和 Ca²⁺ 的二级网络生成 SMART（图 1I）。与 SMA 中微凝胶的光滑表面相比，SMART 的横截面上显示出相互连通的多孔结构（图 1J）。傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 分析在 1731、1779、1810 cm^-1 处出现的特征峰对应 NHS 酯和酰亚胺的 C═O 伸缩振动（图 1K）。PAA 网络的引入增强了 SMART 在 1712 cm^-1 的 C═O 吸收峰。流变分析显示储能模量（G′）始终大于损耗模量（G″），符合块状凝胶特性（图 1L）。SMA 和 SMART 的强烈频率依赖性揭示了体系内的超分子相互作用。由于 PAA-Ca²⁺ 网络的加入，SMART 在应变扫描中表现出更高的 G′值和更高的屈服点（图 1M）。此外，时间扫描测试证实了 SMART 的优异剪切稀化和自修复性能，与切割和重新连接实验结果一致（图 1N，O）。SMART 还表现出快速温度响应，有助于伤口机械收缩，其自修复性来源于羧基之间的氢键以及羧基与 Ca²⁺ 间的动态配位，并通过调节交联密度即可调节其力学性能。

图1.微凝胶的组装导致了表现出优异机械性能的 SMART 的形成。A) SMART 制造过程示意图。B) 荧光标记微凝胶的 CLSM 图像。C) 显示微凝胶核壳结构的 TEM 图像。D) 通过 DLS 获得的微凝胶的尺寸分布。E) 描绘微凝胶的流体动力学直径与温度关系的图表。F) 时间相关 CLSM 图像显示添加 EDC 后微凝胶的组装过程。G) 显示块体 SMA 的圆盘状形态的光学图像。H) SMA 的 SEM 图像显示其内部多孔形态。I) SMART 的宏观形态。J) SMART 剖面结构的 SEM 图像。K) 微凝胶、SMA 和 SMART 的 FT-IR 光谱。L、M) 使用频率扫描和应变扫描对 SMA 和 SMART 进行流变分析。N) SMART 的循环应变图。 O) 光学图像展示了 SMART 的自修复特性

（2）智能敷料通过程序化自我收缩实现外泌体的自发加载和持续释放

与微凝胶固有的触发自收缩特性一致，SMART 敷料在接近正常体温时会瞬时自收缩（图 2A）。在 37°C 下，其直径（d1/d0、h1/h0）分别缩小至 54.48％ 和 55.12％（图 2B）。随着钙浓度的增加，SMART hc 敷料在 EDS 图中显示更强的 Ca Kα1 信号，且体积收缩减少（图 2C-E）。为利用外泌体的皮肤修复能力，提取了 hMSC 分泌的外泌体，大小分布为 30-200 nm（图 2F），并通过 CD81 和 β-actin 的标记验证纯度（图 2G）。TEM 和 SEM 图显示其杯状囊泡结构，表明外泌体收集成功（图 2H、I）。当环境温度低于 SMART 的 LCST 时，酰胺基团与水形成氢键，促进体积膨胀和外泌体扩散并有效装载；高于 LCST 时，氢键断裂引发体积收缩，释放外泌体（图 2J）。CLSM 图像显示荧光标记的外泌体在 SMART 内均匀分布并保持稳定长达 14 天，超 90％ 外泌体可顺畅释放，尤其在最初 3 天内持续释放（图 2K、L）。SMART-EXO 保持与 SMART 相似的机械性能，且粘度随剪切速率增加呈线性下降（图 2M-O）。综上，SMART 通过自收缩有效负载干细胞衍生外泌体，实现稳定释放，同时不影响机械性能。

图2.SMART 能够在温度变化下自发装载和持续释放外泌体。A) SMA 的可编辑自收缩和强大的组织粘附性。B) SMART 和 SMART_hc在 0 或 37 ℃ 下 10 min在 TCPS 上的照片。C) SMART 和 SMART_hc横截面上钙分布的 EDS 映射。D) SMART 和 SMART_hc横截面上记录的钙定量的 EDS 映射。E) 比率d 1 / d 0和h 1 / h 0量化 SMART 和 SMART hc ( n = 3)不同轴上的收缩比率。F) 外泌体直径大小分布直方图。G) Western blot。H) SEM 图像I) TEM 图像。J) SMART 通过响应温度变化的瞬时自我收缩来装载和释放外泌体的示意图。K) SMART-EXO（n ≥ 5）中外泌体的累积释放曲线。L) CLSM 图像。M) SMART-EXO 敷料的机械性能。N) SMART-EXO 的振荡应变扫描。O) 剪切作用下 SMART-EXO 的粘度变化

（3）SMART-EXO 敷料具有优异的粘附性和原位触发自收缩功能，可增强伤口闭合

当应用于湿润和受伤组织时，SMART-EXO 敷料中的羧基能迅速与皮肤组织中的胺基形成氢键，10秒内实现稳定粘附。该敷料在猪皮和心脏样本上表现出强大粘附力，即使在扭曲、弯曲或冲洗下仍保持牢固（图 3A、B）。在弯曲或浸泡于 PBS 12小时后，该敷料仍能紧密附着于鸡皮样本（图 3C）。特别是，SMART-EXO 敷料可有效粘附在充满模拟肠液（SIF）的受损猪肠外表面，并通过自我收缩密封伤口（图 3D）。在猪皮上的剪切强度和伤口闭合强度分别超过 56 kPa 和 1.5 N，平均界面韧性为 81 J m ⁻²。值得注意的是，喷洒生物相容性碳酸氢钠溶液后，界面韧性降至 11.94 J m ⁻²，便于非侵入性去除敷料（图 3F）。

此外，SMART-EXO 敷料在接近正常体温下能快速自收缩，主动缩小伤口面积（图 3G）。体外测试显示，在离体糖尿病小鼠皮肤上的直径8毫米伤口区域，敷料在 37°C 下立即收缩，使伤口轴径（d1/d0、h1/h0）分别减小至 55.18％ 和 56.58％（图 3H）。当钙浓度增高时，SMART hc-EXO 敷料实现了温和的伤口收缩，d1/d0 和 h1/h0 分别降至 77.1％ 和 74.3％（图 3H）。与市售伤口敷料相比，SMART-EXO 表现出更强的粘附性，其更高的剪切强度、伤口闭合强度和界面韧性均显著提升（图 3E）。通过简单调节交联点密度，SMART-EXO 可实现自收缩过程的精确控制，从而编程化调节伤口机械收缩。

图3.  SMART-EXO 表现出优异的粘附性、可触发分离和可编程的自收缩，可用于皮肤伤口闭合。SMART-EXO 与 A) 猪皮、B) 猪心、C) 鸡皮和 D) 猪肠的粘附性。E) SMART-EXO 在湿猪皮上的剪切强度、伤口闭合强度和界面韧性。F) 图表说明了 SMART-EXO 的湿粘附和可触发分离。G) SMART-EXO 或 SMART hc -EXO 通过外泌体释放促进伤口愈合的示意图。 H) SMART-EXO 或 SMART hc -EXO 在 0 或 37 °C 下 10 分钟时在离体糖尿病小鼠皮肤伤口表面的照片；比率d 1 / d 0和h 1 / h 0量化了伤口或伤口hc不同轴的收缩率

（4）SMART-EXO 敷料通过结合生物力学和生化线索加速糖尿病伤口闭合

为评估伤口的机械收缩及外泌体释放对糖尿病伤口愈合的影响，在糖尿病 db/db 小鼠的全层切除伤口上分别施用 SMART-EXO 敷料（“SMART-EXO”组）、普通 SMART 敷料（“SMART”组）和外泌体悬浮液（“EXO”组），未处理伤口作为对照（图 4A）。结果显示，SMART-EXO 组的愈合速度最快（图 4B），至第16天伤口面积仅为初始的 8.3% ± 3.20%（图 4C）。SMART 组（37.00% ± 5.65%）和 EXO 组（46.16% ± 13.59%）的伤口面积显著小于对照组（68.35% ± 11.38%），表明机械线索和外泌体的生化线索均促进了伤口闭合。苏木精-伊红染色分析显示，第8天 SMART-EXO 组的表皮厚度为145 µm，高于 SMART 组（107 µm）、EXO 组（110 µm）和对照组（27 µm）（图 4D、E）。然而，第16天时，SMART-EXO 组的表皮层最薄（图 4F）。相较对照组，SMART 和 SMART-EXO 组表现出更多的胶原沉积，且 SMART-EXO 组胶原束更有序，表明成熟胶原束的存在（图 4I）。此外，SMART-EXO 组的 CD31 和 α-SMA+ 表达显著高于其他组（图 4G、H、J、K），表明通过 SMART-EXO 敷料的机械收缩改变伤口应力水平，有助于血管生成和肌成纤维细胞再生。结果表明，SMART-EXO 敷料可通过提供机械收缩和外泌体，实现复杂皮肤结构和细胞的有效重建。糖尿病小鼠伤口模型证实，SMART-EXO 敷料能加速伤口愈合，且无明显不良影响。

图4. SMART-EXO 敷料可加速 db/db 小鼠的伤口愈合。A) 全层切除伤口实验设计示意图。B) 用 SMART 和 SMART-EXO 治疗 16 天的伤口代表性图像。C) 16 天内残留伤口大小的量化。D) 第 8 天和第 16 天伤口皮肤的苏木精-伊红染色。E、F) 伤口皮肤表皮厚度的量化I) 小鼠组织切片 Masson 三色染色的代表性图像。 J) CD31 和 K) α-SMA +在第 16 天的代表性免疫荧光图像。G、H)第 16 天 ( n ≥ 4) 的 G) CD31 和 H) α-SMA +的相对面积覆盖率

5）SMART-EXO 敷料通过激活皮肤机械转导和促进血管生成和上皮再生来加速糖尿病皮肤伤口愈合

  与 SMART 组相比，在第16天，SMART-EXO 组显示出磷酸化 PI3K (p-PI3K)、磷酸化 RAF (p-RAF)、磷酸化 AKT (p-AKT) 和磷酸化 Erk1/2 (p-Erk1/2) 的显著上调（图 5A、B），表明 EXO 可能激活了 PI3K/AKT 和 MAPK/Erk 通路（图 5C）。主成分分析（PCA）显示对照组、SMART 组和 SMART-EXO 组之间的转录组谱存在差异性聚类（图 5D）。差异基因表达分析显示，SMART 组相比对照组有 3609 个显著修饰基因（2138 个上调），SMART-EXO 组有 1888 个基因（1173 个上调），SMART-EXO 与 SMART 相比有 811 个基因（410 个上调）（图 5E-G）。信号通路富集分析显示，SMART-EXO 组在 PI3K/AKT、MAPK 和 HIF-1 通路中表现出显著富集（图 5H），表明 EXO 在细胞增殖、血管生成和炎症调节中发挥作用。此外，与对照组相比，SMART-EXO 在 TGF-β/Smad 和 Hippo 等与机械转导相关的通路中表现出反应富集（图 5I），暗示 SMART 引发的机械收缩可促进成纤维细胞转化、胶原形成和组织发育。GO 分析进一步表明，SMART-EXO 相比 SMART 组在细胞增殖、迁移和血管重塑等多个过程中的基因富集（图 5J）。此外，SMART-EXO 组在肌肉收缩、肌动蛋白细胞骨架重组、平滑肌组织发育、上皮细胞迁移、血管内皮细胞迁移和血管生成等方面显示出富集（图 5K）。整体而言，这些结果表明，SMART-EXO 敷料通过机械和生化双重调节加速了糖尿病小鼠皮肤伤口的多种修复过程，包括细胞迁移、增殖、血管生成和再上皮化（图 6）。

图5. SMART-EXO 通过促进细胞迁移、增殖、血管生成和上皮化来加速糖尿病皮肤伤口愈合。A) 受伤后第 16 天伤口皮肤组织裂解物中 p-PI3K、p-RAF、p-AKT、p-Erk1/2 和 β-actin 的免疫印迹。B) 第 16 天伤口皮肤中 p-PI3K、p-RAF、p-AKT 和 p-Erk1/2 的相对蛋白表达水平。C) SMART-EXO 激活的 AKT 和 Erk1/2 通路示意图。D) 主成分分析 (PCA) 图。火山图显示 E) SMART 与对照、F) SMART-EXO 与对照和 G) SMART-EXO 与 SMART 的基因差异表达谱。使用 H、I) Reactome 和 J、K) 基因本体 (GO) 数据库中的 SMART-EXO 与 SMART 和 SMART-EXO 与 SMART 的表达基因进行功能过度表达分析

图6.SMART-EXO 加速伤口愈合的机制

研究小结：

该研究通过整合 MSC 衍生外泌体于自收缩核壳微凝胶组件中，开发出一种多功能生物活性核壳微凝胶组件 (SMART-EXO)，具备强大组织粘附性。SMART-EXO 具备可逆湿生物粘附性，其粘附性优于多种现有产品，如医用敷料、透明敷料、手术密封剂和贴片，并可轻松无创移除。体外实验显示，SMART-EXO 通过可调节自收缩和持续外泌体释放，具备促进伤口愈合的潜力。在 II 型糖尿病小鼠模型中，SMART-EXO 通过激活皮肤机械传导和调节与细胞增殖、血管生成及肌肉收缩相关的关键信号通路，加速伤口闭合。该系统在慢性糖尿病伤口护理及其他受损组织的紧急止血中展现出巨大临床应用前景。