IF:11.7《Science Advances》苏大陈亮:磁吸引水凝胶重塑铁代谢以修复组织
专栏:学术前沿
发布日期:2024-10-08
作者:创赛科研

铁死亡(Ferroptosis)是一种新发现的程序性细胞死亡方式,因其与细胞铁代谢失调密切相关而备受关注。铁过载会通过Fenton反应产生大量活性氧(ROS),进而氧化细胞膜或细胞器膜上的多不饱和脂肪酸(PUFAs),导致细胞死亡。铁死亡已被证实与椎间盘退变(IVDD)相关,过多的ROS会引发髓核细胞(NPCs)的线粒体功能障碍,扰乱细胞外基质(ECM)的合成与分解平衡。目前,一些疗法通过去除细胞内铁(in-iron)来抑制铁死亡,尽管这些方法显示出一定效果,但体外铁(ex-iron)的作用尚未得到充分研究。体外铁的累积通过转铁蛋白受体1(TFR1)和二价金属离子转运蛋白1(DMT1)等分子进入细胞,进而诱导铁死亡。研究表明,体外铁的富集是细胞内铁过载的重要来源,因此消除体外铁的积累对于长期抑制铁死亡具有重要意义


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针对上述问题,苏州大学附属第一医院陈亮副院长团队通过组织学和分子生物学方法分析了人体和大鼠退化髓核中的铁含量和相关生物标志物的变化。受磁铁吸引金属的自然现象启发,该研究团队构建了一种基于F127和鞣酸(TA)的磁吸引温敏水凝胶(FDA-TA),该水凝胶能够通过温敏特性有效填充椎间盘间隙,并利用光固化提高其机械性能。鞣酸通过螯合体外铁,显著降低了退化髓核中的铁含量,从而抑制了铁死亡相关的铁蛋白自噬(Ferritinophagy)。体内验证了该铁螯合系统的治疗效果,为组织修复提供了一种潜在的解决方案。该文章以《Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair》为题于2024年8月16日发表于《Science Advances》期刊(DOI: 10.1126/sciadv.ado7249)。


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图1. 磁性吸附水凝胶的制备及重塑铁代谢治疗IVDD的示意图


(1)IVDD 中的铁离子浓度积累和铁死亡


铁死亡是一种新的程序性细胞死亡形式,该研究中首次揭示了其在椎间盘退变(IVDD)中的重要性。通过分析人类和大鼠退化髓核(NP),该研究团队发现体外铁(ex-iron)浓度随着退变的加重而显著增加,并与铁死亡的发生密切相关。在MRI检测中,中度退变患者(Pfirrmann分级II-III)的髓核显示较轻的信号减弱,而重度退变患者(分级IV-V)髓核信号明显减弱(图2A, 2B)。在组织学检测中,普鲁士蓝染色显示重度退变组的棕色颗粒显著多于中度退变组(图2C),两组之间的差异具有统计学意义(图2D, p < 0.01)。这些颗粒表明铁离子在退变组织中的沉积增加。此外,GPX4和FTH1免疫荧光染色结果显示,中度退变组的荧光强度显著高于重度退变组(图2E),GPX4表达水平高出1.54倍,FTH1高出1.82倍(图2F)。铁离子浓度与GPX4、FTH1表达水平呈显著负相关(图2G-I, p < 0.05),与退变程度呈显著正相关(图2J, p < 0.01)。


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图2.验证人类退行性神经髓系组织中铁离子浓度与铁死亡及退化程度的相关性。(A)椎间盘中度退变的MRI图像;(B)椎间盘重度退变的MRI图像;(C)不同退变程度的NP组织普鲁士蓝增强染色、GPX4和FTH1免疫荧光双标染色;(D)普鲁士蓝增强染色阳性面积定量分析和免疫荧光强度半定量分析(n=6);(E)不同退变程度的GPX4和FTH1的WB分析(n=3);(F至I)铁离子浓度与GPX4 mRNA表达、FTH1 mRNA表达、GPX4免疫组化阳性细胞数、FTH1免疫组化阳性细胞数的相关性分析;(J)MRI分级与组织铁离子浓度的相关性分析。统计学分析采用Tukey检验,统计学意义设定为P <0.05


在大鼠尾椎IVDD模型中,T2加权MRI结果显示髓核信号强度随着退变加重逐渐减弱,表现为"黑色椎间盘"(图3A)。普鲁士蓝染色显示,重度退变组髓核几乎消失,且该组的铁沉积显著高于对照组和中度退变组(图3C, 3D, p < 0.01)。Western Blot结果显示,GPX4和FTH1表达水平随着退变的加重逐渐降低,重度退变组的GPX4和FTH1表达分别减少了2.1倍和1.9倍(图3B)。免疫组织化学染色结果与上述趋势一致(图3E, 3F, p < 0.05),铁离子浓度与GPX4和FTH1的表达水平呈显著负相关(图3G-K, p < 0.01)。这些结果表明随着IVDD的进展,体外铁的累积是诱导髓核细胞铁死亡的重要因素,且其浓度与退变程度和铁死亡标志物的表达密切相关


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图3. 验证大鼠退化NP组织中铁离子浓度与铁死亡及退化程度的相关性。(A)大鼠不同程度退变椎间盘的MRI图像;(B)退变椎间盘组织中GPX4和FTH1的WB分析(n=3);(C)不同程度退变的普鲁士蓝增强染色、GPX4和FTH1免疫荧光分析;(D)普鲁士蓝增强染色阳性区域定量分析(n=6);(E)FTH1免疫荧光强度半定量分析(n=6);(F)GPX4免疫荧光强度半定量分析(n=6);(G至J)组织铁离子浓度与GPX4 mRNA表达、FTH1 mRNA表达、GPX4免疫组化阳性细胞数、FTH1免疫组化阳性细胞数的相关性分析;(K)MRI级别与组织铁离子浓度的相关性分析。统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验,统计显著性设为P < 0.05。


(2)铁离子在NPC细胞外诱导铁死亡


该研究团队验证了体外铁(ex-iron)浓度、铁死亡与椎间盘退变(IVDD)之间的相关性,并通过体外实验进一步探讨了体外铁对髓核细胞(NPCs)的影响。24小时后,结晶紫染色显示TBHP和Fe³⁺组的细胞增殖显著受抑,且其细胞形态与对照组明显不同。Western Blot结果显示,TBHP和Fe³⁺组的GPX4和FTH1蛋白表达显著低于对照组(图4A),这一结果与免疫荧光分析一致(图4B, 4C, 4F)。作为促进体外铁进入细胞的关键蛋白,转铁蛋白受体1(TFR1)的表达与体外铁浓度密切相关。在Fe³⁺处理后,细胞内铁离子浓度升高,导致TFR1表达增加,而TBHP通过增加细胞内ROS诱导铁死亡,机制与氯化铁不同。Western Blot显示Fe³⁺组的TFR1表达高于TBHP组,双价金属离子转运蛋白1(DMT1)的表达在Fe³⁺组略高于TBHP组,但差异无统计学意义,且两者均显著高于对照组。此外,TBHP和Fe³⁺组中铁输出蛋白(FPN)表达显著低于对照组(图4A)。利用FerroOrange探针检测细胞内Fe²⁺浓度发现,TBHP和Fe³⁺组的荧光强度显著增强,且Fe³⁺组的强度高于TBHP组,表明Fe³⁺导致细胞内铁离子浓度显著增加,铁代谢紊乱(图4D, 4G)。透射电子显微镜显示,与对照组相比,TBHP组的线粒体密度显著增加,嵴结构消失,而Fe³⁺组的线粒体膜破裂,失去正常结构(图4D)。JC-1检测显示TBHP和Fe³⁺处理后的NPCs线粒体膜电位显著下降,绿荧光增强,提示线粒体功能异常(图4E, 4H)。此外,通过流式细胞术和免疫荧光分析,TBHP和Fe³⁺组中的ROS生成和脂质过氧化水平显著高于对照组(图4I, 4J, 4L,图S2)。划痕实验表明,两组细胞的迁移能力显著下降,细胞活力降低(图4K, 4M)。


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图4. 铁离子诱导NPC铁死亡的体外验证。(A)不同组别铁死亡相关指标的WB分析(n=6);(B)GPX4荧光强度半定量分析(n=6);(C)GPX4和FTH1免疫荧光染色;(D)FerroOrange探针染色及TEM观察NPCs线粒体形态(黄色箭头表示线粒体);(E)JC-1染色检测线粒体膜电位;(F)FTH1荧光强度半定量分析(n=6);(G)FerroOrange荧光强度半定量分析(n=6);(H)JC-1染色荧光强度半定量分析(n=6);(I)H2DCFDA和C11-BODIPY581/591的流式细胞术定量分析(n=6);(J)H2DCFDA和C11-BODIPY581/591的流式细胞术分析;(K)划痕试验评估不同组别中NPC的活性;(L)C11-BODIPY581/591流式细胞术定量分析(n=6);(M)划痕试验愈合定量分析(n=6)。统计分析采用方差分析和Tukey事后检验,统计学显著性设定为P < 0.05


(3)靶向磁性吸附水凝胶的制备、表征及生物相容性评价


研究人员通过在F127分子链上引入丙烯酸酯基团(diacrylate),构建了具有光固化能力的FDA水凝胶,使其在光交联后表现出优异的机械性能,能够模拟髓核的机械强度。鞣酸(TA)赋予水凝胶铁离子吸附能力,其丰富的酚羟基具有良好的抗氧化能力,能够有效中和ROS,并通过与金属离子螯合抑制铁死亡。水凝胶在紫外光交联后形成均匀胶体,加入TA后,FDA-TA呈现浅黄色(图5A)。扫描电子显微镜显示三组水凝胶均具有相对均匀的孔结构(图5B),孔径分别为282.7 ± 77.97 μm(G2组),188.4 ± 76.06 μm(G3组),184.4 ± 97.68 μm(G4组)。进一步将水凝胶置于100 μM的氯化铁溶液中评估其吸附铁离子的能力,G2组由于较高的TA比例和较大孔径,吸附能力最强,整个胶体呈黑色(图5C, E)。通过压缩模量和拉伸模量检测,发现G3组具有最佳的机械性能,且其模量与G4组无显著差异(图5G-J)。水凝胶的自愈合性能通过流变学测试进行评估,结果显示FDA-TA水凝胶具有良好的自愈能力(图5K)。


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图5. 靶向磁性水凝胶的制备及表征。(A)FDA和FDA-TA水凝胶交联前后的全景图;(B)不同体积比(G2=2:1、G3=3:1和G4=4:1)水凝胶的SEM分析;(C)不同组水凝胶体外吸附铁离子的Mapping分析;(D)水凝胶孔径分析(n=15);(E)不同组(n=4)Mapping荧光强度半定量分析;(F)不同组水凝胶(n=3)的紫外交联时间测定;(G和H)不同组水凝胶(n=3)的压缩模量曲线及分析;(I至J)不同组水凝胶(n=4)的拉伸模量曲线及分析;(K)水凝胶流变性测试以评估自修复性能;(L)水凝胶韧性的展示。统计分析采用Tukey事后检验的方差分析进行,统计显著性设为P < 0.05


(4)靶向水凝胶体外抑制NPC铁死亡


异常铁代谢是导致铁离子分布不均的重要原因。髓核细胞(NPCs)的表型变化在椎间盘退变(IVDD)过程中加剧了铁代谢紊乱,增加的体外铁(ex-iron)浓度加重了细胞功能障碍,形成恶性循环。共培养实验分为对照组、Fe³⁺组、FDA组、去铁胺(DFO)组和FDA-TA组。作为常用铁螯合剂,DFO被用作阳性对照,以评估靶向水凝胶螯合铁离子的能力。在100 μM的氯化铁溶液刺激24小时后,综合评估了各组的疗效。DFO能够螯合细胞内Fe²⁺,而FDA-TA则可以螯合体外铁并重塑铁代谢,从而抑制铁死亡。DMT1和TFR1在Fe³⁺组和FDA组中显著升高,而ECM主要成分ACAN和COL-II的表达在DFO组和FDA-TA组中明显增强(图6B-D)。通过荧光探针检测,Fe³⁺组和FDA组中细胞内Fe²⁺浓度显著高于其他三组(图6E, F)。同时,透射电子显微镜显示,Fe³⁺组和FDA组中线粒体结构致密,嵴结构消失,而DFO组和FDA-TA组中的线粒体结构相对正常(图6F)。JC-1染色表明,Fe³⁺组和FDA组的绿色荧光强度显著增强,表明线粒体膜电位下降(图6, G-J)。ROS生成和脂质过氧化水平的检测结果显示,DFO组和FDA-TA组中ROS和脂质过氧化显著减少,而Fe³⁺组和FDA组中显著增加(图6H-I, K)。这些结果表明,靶向水凝胶能够减少体内铁的积累,抑制NPCs的铁死亡并保持细胞活性


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图6.靶向水凝胶体外重塑铁代谢。(A)共培养实验示意图;(B至D)WB结果及铁死亡相关指标和ECM合成相关指标的统计分析(n=6);(E)FerroOrange荧光强度半定量分析(n=6);(F)FerroOrange探针染色及TEM观察NPCs线粒体形态(黄色箭头表示线粒体);(G)JC-1染色荧光强度半定量分析(n=6);(H)流式细胞术定量分析H2DCFDA(n=6);(I)流式细胞术定量分析C11-BODIPY581/591(n=6);(J)NPCs的JC-1染色;(K)H2DCFDA和C11-BODIPY581/591流式细胞术分析。统计分析使用Tukey事后检验的方差分析进行,统计显著性设定为P < 0.05


(5)靶向水凝胶通过激活 PI3K-AKT 通路抑制 NCOA4 介导的铁蛋白吞噬


对Fe³⁺组和FDA-TA组的细胞进行转录组测序分析。KEGG富集分析显示磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT通路在上调的前20条通路中显著上调(图7A),而铁死亡和自噬等生物变化显著受到抑制(图7B)。GSEA结果与KEGG分析一致(图7C)。基于这些结果,该研究团队推测靶向水凝胶治疗IVDD时,可能通过激活PI3K-AKT通路抑制由细胞内铁过载引发的铁蛋白自噬,从而抑制NPCs的铁死亡。为验证这一假设,研究团队对人类和大鼠退化的髓核组织进行了分析。Western Blot结果显示,严重退变患者中LC3b II/I和NCOA4的表达显著高于中度退变患者(图7D),而免疫组化分析表明,p-PI3K和p-AKT阳性细胞在严重退变组中显著少于中度退变组(图7E)。在大鼠髓核中也观察到相同的趋势(图7F, 7G)。体外实验中,LC3b免疫荧光分析显示Fe³⁺组和FDA组中LC3b点数量更多,荧光强度显著增强(图7H, 7I)。作为铁螯合剂,去铁胺(DFO)通过降低细胞内铁浓度抑制铁蛋白自噬,因此LC3bII/I和NCOA4表达在DFO组中显著降低。


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7.靶向水凝胶激活PI3K-AKT通路,抑制NPC中的铁蛋白吞噬作用。A)上调信号通路KEGG富集分析;(B)下调生物学行为KEGG富集分析;(C)PI3K-AKT、铁死亡、自噬-动物GSEA富集分析;(D)人退行性NP组织中LC3b和NCOA4蛋白的表达情况;(E)人退行性NP组织p-PI3K和p-AKT免疫组化染色;(F)大鼠退行性NP组织中LC3b和NCOA4蛋白的表达情况;(G)大鼠退行性NP组织p-PI3K和p-AKT免疫组化染色;(H)NPCs的LC3b免疫荧光染色;(I)LC3b免疫荧光强度半定量分析(n=5)。统计分析采用Tukey事后检验的方差分析进行,统计显著性设定为P < 0.05。FDR,错误发现率;NES,标准化富集分数


(6)靶向水凝胶减轻体内铁蛋白吞噬作用,抑制铁死亡,并治疗大鼠IVDD


通过大鼠尾椎刺穿建立IVDD模型,分别注射氯化铁、FDA、DFO和FDA-TA溶液,以Co5/6椎间作为对照组(图8A)。术后4周和8周进行了放射学检查,主要指标为MRI T2加权图像的椎间盘信号强度和椎间隙高度(图8B)。通过计算4周和8周的椎间盘高度指数,观察到所有实验组的椎间隙高度都有所下降。然而,FDA-TA组的下降速度较慢,8周时与对照组的差异显著,显示出比其他实验组更优的效果(图8C)。MRI结果显示,随着退变时间的推移,各实验组的椎间盘信号强度都有一定程度的下降,但FDA-TA组的信号强度最接近对照组(图8G, H)。作为细胞内铁螯合剂,DFO可以防止铁过载,但易泄漏且无法提供椎间盘的机械支持,导致椎间盘恢复效果有限。通过H&E和Safranin-O(S&O)快速绿染色观察髓核组织体积和椎间盘结构边界,结果表明Fe³⁺组和FDA组的髓核逐渐减少,并在第4至第8周被纤维环组织替代,结构不清晰。虽然DFO组仍保留了一部分髓核,但髓核与纤维环组织之间的边界模糊。而在FDA-TA组中,髓核体积增加且边界清晰,其组织学评分接近对照组(图8D-E, I-J)。LC3b和NCOA4免疫组化结果表明,Fe³⁺组和FDA组中阳性细胞数显著高于DFO组和FDA-TA组,表明NCOA4介导的自噬在DFO组和FDA-TA组中被抑制(图8F)。


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图8.靶向水凝胶重塑体内铁代谢和IVDD。(A)动物实验概述;(B)大鼠退化椎间盘的MRI和X光检查分析;(C)椎间盘间隙的DHI%分析;(D)治疗后4周和8周的H&E染色(DHI,椎间盘高度指数);(E)治疗后4周和8周的S&O染色;(F)治疗8周后的LC3b和NCOA4免疫组织化学染色;(G)治疗后4周(n=5)的MRI分类的统计分析;(H)治疗后8周(n=5)的MRI分类的统计分析;(I)治疗后4周(n=5)的组织学发现的统计分析;(J)治疗后8周(n=5)的组织学发现的统计分析。统计分析采用单因素或双向方差分析和Tukey事后检验,统计显著性设为P < 0.05


研究小结:

本研究发现,在退化的神经髓鞘组织中,外铁离子浓度显著升高,且与退化程度呈显著正相关。该研究团队针对这一问题,设计了一种靶向外铁离子的磁性FDA-TA水凝胶。体外研究表明,磁性水凝胶显著清除外铁离子积累引起的ROS和铁代谢紊乱。转录组测序显示,靶向水凝胶激活了PI3K-AKT通路,从而抑制了NCOA4介导的铁蛋白吞噬。通过“内外联系”维持铁内稳态。最后,在体内证实了靶向水凝胶的治疗效果和机制。这种靶向外铁离子的磁性水凝胶重塑铁代谢过程,为组织修复提供了一种有前途的临床解决方案。

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