骨肉瘤是最常见的儿童和青少年恶性骨肿瘤，常规治疗方法包括手术切除、新辅助化疗、放疗和免疫治疗。这些治疗尽管能控制肿瘤的进展，但对骨组织的再生却有负面影响，导致患者长期的骨健康风险增加。靶向免疫治疗，如免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫治疗，在血液恶性肿瘤中显示出潜力，但在固体肿瘤如骨肉瘤中，因靶向效率低和局部药物浓度不足而面临挑战。因此，局部递送免疫治疗药物，如抗PD-L1抗体（αPD-L1），被视为增强骨肉瘤治疗效果的有前景方法。此外，hedgehog信号通路的活性已在临床试验（如NCT03282344试验）中得到验证，hedgehog通路抑制剂vismodegib可能成为骨肉瘤治疗的潜在药物，但其具体机制仍需进一步研究。

针对上述问题，华南理工大学边黎明团队设计了一种结合αPD-L1、vismodegib和镁离子的生物活性纳米复合水凝胶，以增强骨肉瘤术后的免疫治疗和骨再生。该水凝胶注射到原发肿瘤切除后的骨缺损部位，能够持续释放αPD-L1和vismodegib，有效调节哨点淋巴结中的免疫反应，增强被肿瘤细胞抑制的CD8+ T细胞活性。同时，释放的镁离子在体外实验中促进了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化，进一步促进术后骨缺损的修复。该纳米复合水凝胶具有清除残余肿瘤细胞和促进骨愈合的双重功能，为骨肉瘤的保肢治疗提供了一种新方案。相关研究于2024年7月27日以《Bioactive nanocomposite hydrogel enhances postoperative immunotherapy and bone reconstruction for osteosarcoma treatment》为题发表于《Biomaterials》（DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122714）。

图1 研究示意图

（1）HA-BP-Mg生物活性纳米复合水凝胶的制备与表征

本研究设计了以透明质酸（HA）为基质，通过巯基-烯点击反应将巯基化双膦酸盐（巯基-BP）与甲基丙烯酸化HA（MeHA）结合，并添加氯化镁（MgCl2）以形成纳米复合水凝胶。扫描电子显微镜（SEM）显示水凝胶内部含有Mg-BP纳米颗粒，结构致密。随着BP和Mg2+浓度的增加，水凝胶的杨氏模量和储能模量均显著提高，使用50 mM BP和Mg2+制备的水凝胶的杨氏模量为6.88 ± 0.28 kPa，具备良好的注射性和可塑性。此外，该水凝胶表现出剪切稀化和快速应力松弛特性（τ1/2 = 35.9 ± 9.7 s），其动态交联网络有利于细胞的渗透和生长。

图2 生物活性纳米复合水凝胶的形成和机械性能

（2）HA-BP-Mg生物活性纳米复合水凝胶实现αPD-L1、维莫德吉和Mg2+的持续共递送

HA-BP-Mg水凝胶用于共递送αPD-L1、维莫德吉（vismodegib）和Mg2+。水凝胶由20 mg/mL HA-BP、50 mM BP和50 mM Mg2+组成，并封装了0.43 mg/mL αPD-L1和1.075 mg/mL维莫德吉。水凝胶能通过注射适应不同形状，并在2周内持续释放αPD-L1和维莫德吉，Mg2+的释放时间超过3周。第三周内，αPD-L1和维莫德吉的释放分别为3%和2.6%。这些药物的顺序释放有助于增强CD8+ T细胞活性，提高肿瘤免疫治疗效果。细胞存活测定显示，3T3和K7M2细胞在水凝胶浸提液中具有良好存活率，分别为87.3%和100.6%。体内植入实验表明，水凝胶逐渐降解，无明显炎症反应或主要器官病变。综合结果表明，HA-BP-Mg水凝胶具有良好的生物相容性和可控的降解性能。

图3 可注射且生物相容性的纳米复合水凝胶能够持续共同递送 αPD-L1、vismodegib 和 Mg2+

（3）生物活性纳米复合水凝胶促进体外hBMSCs的成骨分化

研究表明，镁离子（Mg2+）能通过调节BMP-2和Wnt/β-catenin等信号通路，促进MSC的成骨分化。为了验证Mg2+、αPD-L1和维莫德吉的协同作用，hBMSCs与含有这些成分的HA-BP-Mg水凝胶共培养（包括Gel、Vis-Gel、αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel），并进行7天或21天的成骨诱导。结果显示，与不含Mg2+的对照组（Osteo-IM）相比，含Mg2+的水凝胶组表现出更强的成骨活性和矿物沉积，RT-qPCR分析也显示成骨标志基因表达上调。这些结果表明，HA-BP-Mg水凝胶中持续释放的Mg2+在αPD-L1和维莫德吉的作用下，有效促进了hBMSCs的成骨分化和骨再生。

图4 生物活性纳米复合水凝胶在体外增强hBMSCs的成骨分化

（4）局部共递送αPD-L1和维莫德吉的水凝胶增强体内抗骨肉瘤治疗效果

首先在BALB/c小鼠背部皮下用K7M2细胞构建异位骨肉瘤模型，随后将肿瘤片段移植到胫骨部位。H&E染色证实了皮下和胫骨部位肿瘤细胞的同一性，没有局部转移迹象。接着，对小鼠进行手术处理，仅去除90%的肿瘤组织，以模拟术后残留肿瘤的情况。小鼠被随机分为五组（PBS、Gel、Vis-Gel、αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel组），并在骨缺损处注射水凝胶。结果显示，与PBS或Gel组相比，Vis-Gel或αPD-L1-Gel组（分别释放维莫德吉或αPD-L1）显著抑制了骨肉瘤的生长，肿瘤生长抑制率分别为49.4%和76.2%。特别是Vis-αPD-L1-Gel组（同时释放维莫德吉和αPD-L1）表现出协同的抗骨肉瘤效果，肿瘤生长抑制率达到90.2%。治疗结束时，Vis-αPD-L1-Gel组的小鼠肿瘤重量仅为PBS组的35.5%，显著优于Vis-Gel（75%）和αPD-L1-Gel（59.2%）组。此外，与PBS组相比，Vis-Gel或αPD-L1-Gel治疗显著延长了骨肉瘤小鼠的总生存期，Vis-αPD-L1-Gel组的小鼠生存期更长，中位生存时间（MST）为42天，远高于Vis-Gel（32天）和αPD-L1-Gel（37天）组。Vis-αPD-L1-Gel在治疗过程中没有观察到体重下降，证明了其良好的耐受性和安全性。以上结果表明，通过HA-BP-Mg水凝胶局部共递送αPD-L1和维莫德吉能有效增强抗骨肉瘤的治疗效果。

图5 生物活性纳米复合水凝胶抑制K7M2骨肉瘤术后复发

（5）水凝胶局部共递送αPD-L1和维莫德吉增强骨肉瘤和前哨淋巴结中CD8+ T细胞的活性

研究团队通过流式细胞术和免疫组化（IHC）分析了Vis-αPD-L1-Gel的治疗效果。在前哨淋巴结（SLN）中，Vis-αPD-L1-Gel组的CD8+ T细胞比例增加至22.8%，显著高于其他组。此外，该组的CD8+/CD4+ T细胞比例显著提高至0.33，显示出αPD-L1和维莫德吉的协同作用。然而，脾脏中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞比例变化不明显。进一步的解剖组化分析显示，Vis-αPD-L1-Gel和αPD-L1-Gel组的肿瘤中CD8+ T细胞浸润增加，H&E染色显示这两组的癌细胞死亡显著增多。Ki67和TUNEL检测也验证了这些结果，表明局部注射Vis-αPD-L1-Gel显著增强了肿瘤中CD8+ T细胞的活性，提高了治疗效果。

图6 生物活性纳米复合水凝胶增强骨肉瘤和SLN中CD8+T细胞的活化

（6）生物活性纳米复合水凝胶促进胫骨骨肉瘤引起的骨缺损再生

该团队评估了药物负载的生物活性水凝胶在骨再生中的效果。X光观察显示，PBS组和Gel组的胫骨严重受到肿瘤侵蚀（黄色箭头），而αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel组表现出较好的治疗效果，骨肿瘤侵蚀较少。Micro-CT观察、3D重建和横截面图像显示，Vis-αPD-L1-Gel组的骨矿密度（BMD）和骨矿含量（BMC）显著增加，表明该生物活性纳米复合水凝胶促进了骨再生并抑制了残余肿瘤组织。此外，Vis-αPD-L1-Gel组的骨体积（BV）显著高于PBS和Gel组，但与Vis-Gel和αPD-L1-Gel组没有显著差异。H&E染色显示，PBS、Gel和Vis-Gel组的骨结构受到严重侵蚀，而αPD-L1-Gel和Vis-αPD-L1-Gel组则表现出相对正常的骨结构，证明αPD-L1和维莫德吉的联合递送具有显著的治疗效果。

图7 植入生物活性纳米复合水凝胶促进骨肉瘤引起骨缺损的修复

小结：

本研究开发了一种具有双重功能的生物活性纳米复合水凝胶，用于骨肉瘤手术后的残留肿瘤细胞消除和骨组织再生。该水凝胶通过联合递送αPD-L1、维莫德吉和镁离子（Mg2+），在小鼠胫骨骨肉瘤模型中显著增强了肿瘤特异性CTLs的活性，并促进了分化和浸润。镁离子不仅增强了CD8+ T细胞的活性，还通过提高ALP表达和促进MSC的成骨分化，促进了骨组织的再生。实验结果表明，这种局部应用的水凝胶有效提高了癌症治疗的效果，促进了骨组织的修复，并延长了动物的生存期。这些发现展示了该水凝胶在骨肉瘤治疗中的潜力，同时也强调了进一步研究其长期疗效和安全性的必要性，以及优化药物负载策略的潜在价值。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224002485#sec3