图1. EG-gel的合成与应用示意图。(A) EG-gel的制备流程。(B) EG-gel的应用机制。

图2. sEV与EG-gel的制备及表征。(A) 差速离心和超高速离心分离sEV的流程图。(B) 分离sEV的TEM图像。(C) 分离sEV的DLS粒径分布。(D) 外泌体标志蛋白的Western blot分析。(E) EG-gel制备示意图。(F) EG-gel的代表性照片。(G) 冻干EG-gel的SEM图像。(H) GA、sEV和EG-gel的FT-IR光谱。(I) GA、sEV和EG-gel的拉曼光谱。(J) GA、sEV和EG-gel的UV-Vis吸收光谱。(K) GA、sEV和EG-gel的XRD图谱。

（2）EG-gel的流变学特性、可注射性及体内滞留

流变学筛选确定sEV占总体积1/4的EG-gel为最优配方，其储能模量（G'≈350 Pa）与脑组织天然刚度（0.1–1 kPa）匹配，临界应变达53.3%，远高于脑搏动及轴突损伤阈值。该凝胶具有快速自愈合能力，在0.5%与50%应变循环下G'值数秒内完全恢复；同时表现出显著剪切稀化行为，可顺利通过细针注射而不堵塞。EG-gel可粘附于脑、心、肺、肝、肾、脾等多种新鲜离体组织表面，并具有良好的体外止血性能。体外释放实验显示GA在3天内快速释放，随后缓慢释放至第7天；sEV则以更缓慢、持续的方式释放。EG-gel在7天内基本降解，避免长期滞留。体内荧光成像显示，与游离sEV相比，EG-gel在TBI病灶部位的脑信号显著更高且更持久，证明其3D网络能有效固定并富集sEV。

图3. EG-gel的理化性质及体内滞留。(A) 固定频率1 Hz下EG-gel的应变扫描测试。(B) 四个循环内EG-gel在0.5%（低）和50%（高）应变下的步进应变恢复测试，每步2 min，频率1 Hz。(C) EG-gel的流动曲线。(D) 固定应变0.1%下EG-gel的频率扫描。(E) 固定应变0.1%和频率1 Hz下EG-gel的动态时间扫描。所有流变学测试均在25°C下进行。(F) EG-gel通过细针注射形成一系列三维图案的可注射性展示。(G) EG-gel的组织粘附性。(H) 7天内EG-gel中GA和sEV的累积释放曲线。(I) 7天内EG-gel的降解率。(J) 体内荧光成像流程示意图。(K) 游离sEV和EG-gel组在指定时间点代表性活体荧光图像及第7天离体脑荧光图像。(L) 游离sEV和EG-gel组脑信号（占初始信号百分比）的定量分析。n = 5。

（3）EG-gel对TBI小鼠模型的整体疗效

在C57BL/6小鼠控制性皮质撞击（CCI）模型中，术后立即于损伤部位局部注射给药。行为学结果显示，EG-gel组在术后第3天和第7天的神经功能缺损评分（NSS）、悬吊抓握评分和足失误率均显著改善，而游离sEV组无明显效果。组织学检查显示，EG-gel治疗显著改善了HE染色中的神经元排列紊乱、核溶解及核固缩；Nissl染色显示存活神经元数量增加；TUNEL检测显示EG-gel显著减少凋亡细胞。此外，EG-gel逆转了TBI后急性期水通道蛋白4（AQP4）的上调，提示其可减轻细胞毒性和血管源性水肿。IgG渗漏实验表明EG-gel和GA-gel均能减少血脑屏障破坏后的血浆蛋白外渗。

图4. EG-gel对TBI小鼠模型的整体疗效。(A) TBI小鼠模型及原位EG-gel注射示意图。实验时间跨度为7天，行为学测试在第1、3、7天进行。(B) Sham、TBI、EG-gel、GA-gel和Free sEV组TBI小鼠的神经功能缺损评分（NSS）。n = 10。(C) TBI小鼠的悬吊抓握评分。n = 10。(D) TBI小鼠的足失误率。n = 10。(E) 第3天和第7天皮质损伤区的HE染色。(F) 第3天和第7天皮质损伤区的Nissl染色。(G) 第3天和第7天TBI小鼠存活神经元的定量。n = 6–7。(H) 皮质损伤区TUNEL+和AQP4的免疫荧光图像。(I) TUNEL+细胞和AQP4平均荧光强度的定量。n = 3–6。(J) 第3天损伤皮层的代表性IgG免疫染色。

（4）EG-gel治疗TBI的转录组学机制预测

术后第3天取病灶周围皮层进行mRNA测序。主成分分析（PCA）显示三组转录谱明显分离。与Sham组相比，TBI组鉴定出588个差异表达基因（DEGs）；与TBI组相比，EG-gel组鉴定出815个DEGs。Venn分析发现15个被TBI上调但被EG-gel显著逆转的基因，以及43个被TBI下调但被EG-gel上调的基因。KEGG和GO富集分析揭示了三条互补生物学轴：①抗炎轴——EG-gel抑制Aif1、Trem2、Gpsm3、Hspb1等促炎/应激基因，映射到免疫系统和MAPK信号通路；②血管修复与血管生成轴——Mas1、Gucy1a3、Mapk4、Prkca等基因上调，富集于VEGF信号、细胞骨架调控和细胞迁移通路；③神经重塑轴——Syngap1、Pcdhb17、Slc12a5等基因增强表达，关联钙信号、GABA能突触和长时程增强通路，促进轴突再生和突触重塑。

图5. EG-gel治疗TBI的机制预测。(A) Sham、TBI和EG-gel组在转录组空间中的主成分分析（PCA）。(B) Sham vs TBI和TBI vs EG-gel比较的差异表达基因火山图。红点和蓝点分别表示显著上调和下调的基因。(C) 三组间mRNA表达的Venn图。(D) 三组间差异表达基因的热图。(E) 差异表达基因的KEGG通路分析。(F) RNA测序KEGG富集前20项。(G) RNA测序GO富集前20项的柱状图。RNA-seq取损伤周围皮层组织（n = 6），差异表达筛选标准为：倍数变化≥1.5，p < 0.05，q < 0.05，组平均FPKM ≥ 0.5。

（5）EG-gel促血管生成、内皮迁移及抗炎作用的体外与体内验证

体外实验中，EG-gel处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在管腔形成实验中形成显著更密集的血管网络，血管面积百分比、总连接数和平均血管长度均显著增加；小鼠脑内皮细胞（Bend.3）划痕实验显示EG-gel显著促进内皮迁移。在LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型中，GA-gel和EG-gel均能将活化的小胶质细胞形态逆转为静息状态，显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，减少iNOS阳性M1型细胞并增加CD206阳性M2型细胞。体内实验中，EG-gel在术后第1天即显著降低病灶周围促炎因子表达；第3天血清ELISA显示EG-gel同时降低IL-6和TNF-α、升高IL-10和TGF-β1；免疫组化证实EG-gel减少皮层IL-6、TNF-α和IL-1β表达。此外，EG-gel和GA-gel均抑制HMGB1上调并减弱小胶质细胞活化（Iba-1），但仅EG-gel显著降低反应性星形胶质细胞增殖标志物GFAP。

图6. EG-gel促进体外血管生成、内皮迁移并减轻神经炎症。(A) PBS（对照）、EG-gel或GA-gel处理HUVECs 2 h和6 h后的管腔形成代表性图像。(B) 2 h和6 h时血管面积百分比、总连接数和平均血管长度的定量。n = 6。(C) PBS（对照）、EG-gel或GA-gel处理HUVECs 0 h和6 h后的迁移代表性照片。(D) 划痕实验HUVECs的迁移率。n = 5。(E) PBS、LPS、EG-gel或GA-gel处理BV2小胶质细胞后促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的相对mRNA表达。n = 5。(F) BV2细胞形态的明场图像。(G, I) LPS或IL-4刺激BV2的荧光图像及定量。n = 5。(H) TBI小鼠术后第3天血清中促炎因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10、TGF-β1的细胞因子浓度（ELISA）。n = 4–5。(J) 第3天皮质损伤区IL-6、TNF-α和IL-1β的免疫组化图像。

（6）EG-gel促进TBI后神经保护与血管生成

术后第7天，免疫荧光显示EG-gel显著逆转TBI导致的成熟神经元（NeuN）和神经元特异性微管蛋白（β3-tubulin）丢失；轴突再生和突触可塑性标志物GAP43在TBI后下降，经EG-gel处理后恢复至基线水平，提示其促进轴突重塑。血管生成标志物CD31的免疫染色及定量分析显示，EG-gel显著增强TBI后的血管化活性。第7天血清VEGF水平检测显示EG-gel组浓度最高，进一步证明其促进血管修复。上述结果表明，EG-gel中的sEV成分通过激活VEGF、Rap1/Ras-MAPK、钙信号及细胞骨架重塑通路，驱动神经血管修复。

图7. EG-gel促进TBI小鼠神经保护与血管生成。(A, B) TBI后第3天HMGB1的免疫荧光图像（A）和平均荧光强度（B）。(C, D) TBI后第3天GFAP平均荧光强度的代表性图像（C）和定量（D）。(E, F) TBI后第3天Iba-1的免疫荧光图像（E）和平均荧光强度（F）。(G, H) TBI后第7天NeuN和β3-tubulin的免疫荧光照片（G）和定量（H）。(I, J) TBI后第7天GAP43的免疫荧光图像（I）和定量（J）。(K, L) TBI后第7天CD31的免疫荧光照片（K）和平均荧光强度（L）。每组标志物的代表性免疫荧光图像（左）和相应定量（右）均列出，n = 5–6。

（7）EG-gel的生物相容性评价

EG-gel在体外溶胀实验中未出现正溶胀，表现为进行性质量减少，第7天完全失去可测量湿重，提示其不会膨胀压迫周围脑组织。溶血实验显示EG-gel溶血率低于1%，红细胞损伤可忽略。TBI小鼠接受EG-gel治疗后体重稳定，无死亡或异常行为。术后第3天和第7天血清肝肾功能指标（AST、ALT、尿素、肌酐）与Sham组相比无显著变化；心、肺、肝、脾、肾的HE染色未见炎症、坏死或纤维化。离体荧光成像显示荧光信号主要积聚于肝脏，证实肝脏清除是EG-gel的主要代谢途径。

图8. EG-gel的生物相容性。(A) EG-gel的溶胀率。(B) Triton X-100、PBS、EG-gel和GA-gel组的溶血率及代表性照片。n = 5。(C) TBI后第7天肝肾功能标志物的血清水平。n = 6。(D) TBI后第7天各组心脏、肺、肝、脾和肾的HE染色图像。(E) 游离sEV和EG-gel组术后第7天的代表性荧光图像。(F) TBI小鼠术后第7天各组心脏、肺、肝、脾和肾的相对荧光强度。n = 5。