（2）KLF2直接转录抑制DAPK2且抗动脉粥样硬化药物通过KLF2下调DAPK2

为探究DAPK2的上游调控机制，研究团队在HUVECs中过表达一系列血流敏感转录因子，发现KLF2和FOXP1显著抑制DAPK2 mRNA表达，其中KLF2抑制作用最强；而YAP1S127A则显著促进DAPK2表达（图2A）。KLF2敲低显著升高DAPK2 mRNA和蛋白水平，而过表达KLF2则相反（图2B-D）。层流剪切（LSS）下调DAPK2的效应在KLF2敲低后被部分逆转；反之，OSS诱导的DAPK2上调可被KLF2过表达显著抑制（图2E-F）。生物信息学分析显示人DAPK2启动子上游存在3个潜在KLF2结合位点（KBS1：-381/-370 bp；KBS2：-577/-566 bp；KBS3：-758/-747 bp）（图2G）。染色质免疫共沉淀（ChIP）证实KLF2特异性结合于KBS1，而不结合KBS2和KBS3（图2H）。荧光素酶报告基因实验表明，KLF2过表达显著抑制DAPK2启动子活性，而删除KBS1后该抑制作用消失（图2I）。鉴于他汀类药物和白藜芦醇（RSV）可上调KLF2，研究团队检测了它们对DAPK2的影响。辛伐他汀（SMV）、瑞舒伐他汀（RES）和白藜芦醇均显著下调DAPK2 mRNA水平及启动子活性（图2J-K）；而KLF2敲低可消除这些药物对DAPK2的抑制作用（图2L），证实KLF2是介导药物抑制DAPK2所必需的。

图2. 抗动脉粥样硬化药物通过KLF2抑制DAPK2表达。A，过表达N-SREBP2、YAP1S127A、HIF1α、NRF2、FOXP1和KLF2对HUVECs中DAPK2 mRNA的影响（qPCR）。B，KLF2 siRNA（siKLF2）转染后DAPK2和KLF2 mRNA水平。C-D，KLF2过表达（KLF2-OE）或敲低后DAPK2和KLF2的蛋白水平（Western blot）及定量。E，siKLF2转染的HUVECs在静态或LSS条件下DAPK2和KLF2 mRNA水平。F，KLF2-OE转染的HUVECs在静态或OSS条件下DAPK2和KLF2 mRNA水平。G，人DAPK2基因启动子区3个潜在KLF2结合位点（KBS）示意图。H，ChIP实验检测KLF2在DAPK2启动子KBS区的结合。I，荧光素酶报告基因实验检测KLF2-OE对DAPK2启动子（-566/TSS）及KBS1缺失突变体活性的影响。J，SMV、RES和RSV处理24小时后DAPK2和KLF2 mRNA水平。K，荧光素酶实验检测上述药物对DAPK2启动子（-2000/TSS）活性的影响。L，NC或siKLF2转染的HUVECs经SMV、RES或RSV处理后DAPK2 mRNA水平。

（3）DAPK2介导OSS诱导的内皮细胞激活且其激酶活性不可或缺

功能实验表明，DAPK2敲低显著降低静态及OSS条件下HUVECs中VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白水平；反之，DAPK2过表达则显著升高上述粘附分子，并放大OSS的诱导效应（图3A-D）。RNA测序及后续分析显示，DAPK2过表达显著富集于“流体剪切应力与动脉粥样硬化”、“NF-κB信号通路”和“TNFα信号通路”等（图3E-I）。单核细胞-内皮粘附实验证实，DAPK2敲低减少单核细胞粘附，而过表达则增加粘附（图3J-K）。为明确DAPK2激酶活性的必要性，研究团队利用腺病毒在HUVECs中表达野生型DAPK2（DAPK2WT）、激酶死突变体（DAPK2K52A）和组成性激活突变体（DAPK2CA）。结果显示，DAPK2WT和DAPK2CA显著促进OSS诱导的VCAM-1/ICAM-1表达，而DAPK2K52A则显著削弱该效应（图3L-O），表明DAPK2的促炎作用严格依赖其激酶活性。

图3. DAPK2介导OSS诱导的内皮细胞激活。A-B，NC或DAPK2 shRNA（shDAPK2）转染的HUVECs在静态或OSS条件下VCAM1、ICAM1和DAPK2的蛋白（A）及mRNA（B）水平。C-D，Cont-OE或DAPK2过表达（DAPK2-OE）HUVECs中上述分子的蛋白（C）及mRNA（D）水平。E，DAPK2-OE与Cont-OE的PCA图。F，差异表达基因火山图。G，GO生物学过程富集分析。H，KEGG通路富集分析。I，GSEA分析显示“流体剪切应力与动脉粥样硬化”等通路富集。J-K，shDAPK2（J）或DAPK2-OE（K）HUVECs在静态或OSS条件下的单核细胞粘附实验及定量。L-M，FLAG-DAPK2WT或FLAG-DAPK2K52A转染的HUVECs在静态或OSS条件下VCAM1/ICAM1蛋白（L）及mRNA（M）水平。N-O，FLAG-DAPK2WT或FLAG-DAPK2CA转染的HUVECs中VCAM1/ICAM1蛋白（N）及mRNA（O）水平。

（4）内皮特异性DAPK2缺失减轻急性和慢性动脉粥样硬化

为验证DAPK2在体内的功能，研究团队构建了内皮特异性可诱导Dapk2敲除小鼠（Dapk2f/f Cdh5-CreERT2，简称Dapk2iECKO）。分离的Dapk2iECKO小鼠主动脉内皮细胞（MAECs）在OSS刺激下Vcam1和Icam1的上调显著减弱（图4A）。体内部分颈动脉结扎实验显示，Dapk2iECKO小鼠LCA内皮中OSS诱导的Vcam1和Icam1表达显著降低（图4B）。在急性动脉粥样硬化模型中（Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠部分颈动脉结扎+西方饮食），术后2周LCA内皮Vcam1显著降低；术后4周，斑块面积减少约56%，ORO和H&E染色显示脂质沉积和内膜增厚显著减轻（图4C-F）。在慢性西方饮食模型（3个月）中，Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠全主动脉、降主动脉和主动脉根部的斑块负荷均显著减少，且不影响体重和血脂水平（图4G-H）。为进一步验证激酶活性的必要性，研究团队向Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠LCA局部注射编码FLAG-Dapk2WT或FLAG-Dapk2K52A的腺病毒。结果显示，仅Dapk2WT能恢复Vcam1表达、脂质斑块形成和内膜增厚，而Dapk2K52A无此效应（图4I-L）。

图4. DAPK2促进急性和慢性动脉粥样硬化。A，Dapk2WT和Dapk2iECKO小鼠MAECs在静态或OSS条件下Vcam1、Icam1和Dapk2蛋白水平。B，结扎2天后LCA与RCA内皮富集RNA中Vcam1和Icam1 mRNA水平。C，急性模型实验流程示意图。D，术后2周LCA内皮Vcam1免疫荧光及定量。E，术后4周动脉大体病变面积。F，LCA近端、中段、远端的ORO和H&E染色及脂质病变定量。G，3个月西方饮食后全主动脉en face ORO染色及斑块面积定量（全主动脉、降主动脉、主动脉弓）。H，主动脉根部H&E和ORO染色及斑块定量。I，激酶活性拯救实验流程。J，腺病毒注射后LCA内皮Vcam1免疫荧光。K，拯救实验大体病变面积。L，ORO染色及脂质病变定量。

（5）DAPK2与PKM2直接互作并促进其寡聚化及核转位

为寻找DAPK2的下游底物，研究团队对DAPK2过表达的HUVECs进行FLAG免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析，鉴定出83个DAPK2特异性互作蛋白，其中PKM2肽段丰度排名第三（图5A）。结合RNA-seq的GO富集结果，提示PKM2可能是DAPK2的底物。Apoe-/-小鼠主动脉弓en face染色显示，OSS区域（小弯）内皮细胞的核PKM2比例显著高于层流区域（DTA）（图5B）。Co-IP、GST pulldown和邻近连接分析（PLA）证实了DAPK2与PKM2的直接物理互作（图5C-E）。亚细胞定位分析显示，OSS显著促进PKM2核转位，该效应在DAPK2敲低后显著减弱，而DAPK2过表达或组成性激活突变体则增强核转位（图5F-J）。凝胶过滤和戊二醛交联实验表明，DAPK2过表达或OSS刺激均促使PKM2从四聚体（~240 kDa）向二聚体/单体（~120/58 kDa）转换（图5K-L）。机制上，DAPK2WT（而非DAPK2K52A）增强了PKM2与核输入蛋白KPNA1（Importin α5）的互作；KPNA1敲低可阻断DAPK2诱导的PKM2核转位（图5M-N）。使用PKM2四聚体激活剂TP-1454处理可有效抑制OSS或DAPK2过表达诱导的PKM2核转位，并显著降低VCAM-1和ICAM-1的表达（图5O-R）。

图5. DAPK2通过调控PKM2寡聚化和核转位促进OSS诱导的内皮激活。A，IP-MS鉴定PKM2为DAPK2结合蛋白及GO富集整合分析。B，Apoe-/-小鼠DTA与LC内皮核PKM2免疫荧光及定量。C，内源性Co-IP验证DAPK2-PKM2互作。D，GST pulldown实验。E，原位PLA检测HUVECs中DAPK2-PKM2互作（红色为PLA信号）。F，HUVECs在静态或OSS条件下PKM2亚细胞定位免疫荧光及核质荧光强度比。G，核质分离检测PKM2分布。H，活细胞成像追踪GFP-PKM2在OSS刺激后的核转位时程。I-J，shDAPK2对OSS诱导PKM2核转位的影响（IF及核质分离）。K，凝胶过滤分析DAPK2-OE后PKM2寡聚态分布。L，戊二醛交联检测PKM2四聚体、二聚体和单体比例。M，Co-IP检测PKM2与KPNA1的互作。N，siKPNA1对DAPK2-OE诱导PKM2核转位的影响。O-P，TP-1454预处理对OSS诱导VCAM1/ICAM1蛋白（O）及mRNA（P）的影响。Q-R，TP-1454对DAPK2-OE诱导VCAM1/ICAM1蛋白（Q）及mRNA（R）的影响。

（6）DAPK2磷酸化PKM2 Thr45并经由STAT1激活VCAM-1/ICAM-1转录

鉴于PKM2的寡聚态受翻译后修饰调控，研究团队进一步探究DAPK2是否直接磷酸化PKM2。免疫沉淀-PKM2后使用磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体检测显示，DAPK2WT过表达显著增加PKM2磷酸化，而DAPK2K52A无此效应（图6A）。体外激酶实验证实重组DAPK2可直接磷酸化重组PKM2（图6B）。无标记质谱鉴定出PKM2的Thr45为磷酸化位点，该位点在多物种间高度保守；分子对接显示PKM2 Thr45与DAPK2催化环存在强相互作用（图6C-D）。体外激酶实验进一步证实，DAPK2可磷酸化PKM2WT，但不能磷酸化PKM2T45A突变体（图6E）。功能上，OSS显著增加HUVECs中p-PKM2T45水平，该效应被DAPK2敲低消除；DAPK2WT剂量依赖性增加p-PKM2T45，而DAPK2K52A无效（图6F-I）。体内实验中，Apoe-/-小鼠主动脉弓小弯及人颈动脉病变内膜中p-PKM2T45水平显著升高，而内皮特异性Dapk2敲除可显著降低小鼠主动脉弓p-Pkm2T45（图6J-K）。凝胶过滤和交联实验表明，磷酸化拟态突变体PKM2T45E促进四聚体向二聚体/单体转换及核转位，而非磷酸化突变体PKM2T45A则阻断该过程（图6L-N）。PKM2T45E过表达增加VCAM-1/ICAM-1，PKM2T45A则显著削弱OSS诱导的粘附分子表达（图6O）。

转录因子富集分析显示STAT1是DAPK2过表达后最显著富集的靶点（图7A）。OSS诱导STAT1 Tyr701磷酸化（p-STAT1Y701），该效应被DAPK2敲低或激酶死突变削弱（图7B-E）。DAPK2与PKM2WT共表达显著增强STAT1报告基因活性，而PKM2T45A则废除该效应（图7F）。ChIP实验显示，DAPK2过表达促进STAT1和PKM2募集至VCAM-1启动子（-256/-245 bp）和ICAM-1启动子（-77/-66 bp）的STAT1反应元件（SRE）；Re-ChIP证实STAT1与PKM2在同一启动子区域共占据（图7G-I）。荧光素酶实验表明，DAPK2增强VCAM-1/ICAM-1启动子活性依赖于PKM2WT及完整的SRE位点，PKM2T45A或SRE缺失均阻断该效应（图7J）。

图6. DAPK2通过PKM2 Thr45磷酸化促进OSS诱导的内皮激活。A，PKM2免疫沉淀后磷酸化丝氨酸/苏氨酸检测。B，体外激酶实验（HIS-DAPK2 + GST-PKM2）。C，LC/MS鉴定PKM2 Thr45磷酸化肽段图谱及跨物种保守性分析。D，DAPK2与PKM2的分子对接。E，体外激酶实验验证PKM2WT与T45A突变体。F，静态或OSS条件下HUVECs p-PKM2T45水平。G，NC或shDAPK2 HUVECs中p-PKM2T45水平。H，梯度DAPK2-OE后p-PKM2T45水平。I，DAPK2WT或K52A转染后p-PKM2T45水平。J，Dapk2WT与Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠DTA与LC中p-Pkm2T45免疫荧光。K，人颈动脉病变与非病变内膜p-PKM2T45免疫荧光。L，PKM2WT/T45E/T45A的凝胶过滤分析。M，PKM2WT/T45E/T45A的戊二醛交联分析。N，PKM2WT/T45E/T45A的核质分离。O，PKM2WT或T45A转染HUVECs在静态或OSS下VCAM1/ICAM1 mRNA水平。

图7. STAT1激活介导DAPK2-PKM2轴诱导的VCAM-1/ICAM-1上调。A，基于TRRUST数据库的转录因子富集分析。B，静态或OSS下HUVECs p-STAT1Y701水平。C，p-STAT1Y701免疫荧光。D，DAPK2WT或K52A转染后p-STAT1Y701水平。E，小鼠主动脉弓DTA与LC中p-Stat1Y701免疫荧光。F，STAT1报告基因荧光素酶实验。G，人VCAM1和ICAM1启动子区SRE位点示意图。H，ChIP检测STAT1和PKM2在VCAM1/ICAM1启动子SRE区的结合。I，Re-ChIP验证PKM2-STAT1复合物在启动子上的共占据。J，VCAM1/ICAM1启动子荧光素酶实验检测PKM2WT/T45A的影响。

（7）选择性DAPK2抑制剂DAPK-IN-2有效减轻内皮炎症和动脉粥样硬化

为评估DAPK2的靶向治疗潜力，研究团队筛选了选择性DAPK2抑制剂DAPK-IN-2。分子对接显示其结合于DAPK2的ATP结合口袋（对接评分：-7.4），ADP-Glo激酶实验测得IC50为5.209 ± 0.819 μM（图8A-C）。DAPK-IN-2在10 μM以内不影响HUVECs活力（图8D）。体外实验中，DAPK-IN-2（5-10 μM）显著抑制OSS诱导的VCAM-1/ICAM-1表达，并降低p-PKM2T45和p-STAT1Y701水平（图8E-G）。在体内急性模型中，Apoe-/-小鼠部分颈动脉结扎后给予DAPK-IN-2（10或20 mg/kg，隔日腹腔注射），术后2周LCA内皮Vcam1显著降低；术后4周，斑块面积、脂质沉积（ORO）和内膜增厚均显著减少（图8H-K）。在慢性西方饮食模型（2个月）中，DAPK-IN-2显著降低全主动脉、主动脉弓和主动脉根部的脂质斑块负荷，且不影响体重和血脂（图8L-M）。遗传学验证显示，在Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠中，DAPK-IN-2的抗动脉粥样硬化效应显著减弱，证实其靶点为内皮DAPK2。

图8. DAPK2药理学抑制减轻OSS诱导的内皮炎症和动脉粥样硬化。A，DAPK-IN-2化学结构。B，DAPK-IN-2与DAPK2激酶域的分子对接。C，ADP-Glo激酶实验测定IC50。D，CCK-8检测不同浓度DAPK-IN-2处理后的细胞活力。E，DAPK-IN-2预处理对OSS诱导VCAM1/ICAM1蛋白的影响。F，DAPK-IN-2对p-STAT1Y701的影响。G，DAPK-IN-2对p-PKM2T45的影响。H，急性模型给药实验设计。I，术后2周LCA内皮Vcam1免疫荧光。J，术后4周大体病变面积。K，LCA的ORO染色及脂质病变定量。L，2个月西方饮食后全主动脉en face ORO及斑块定量。M，主动脉根部H&E和ORO染色及定量。