方案1. 多功能水凝胶GelMA/dECM@MnO₂-GA的构建及修复机制示意图。

（1）SONFH的病理特征——全身炎症、成骨受损与H型血管减少

研究团队首先通过GEO数据集（GSE123568）比较了SONFH患者与健康对照的外周血基因表达谱，火山图与热图显示SONFH中IL1B、IL6R、TLR2、TLR4等炎症转录本显著上调（图1A-B）。GO富集分析证实其在炎症级联中显著富集（图1C）。进一步对30例SONFH与30例创伤性股骨头坏死（TONFH）的股骨头标本进行对比，大体观察与micro-CT三维重建显示SONFH骨小梁微结构破坏，骨体积分数（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）升高（图1D-F）。Goldner三色染色提示SONFH成骨活性显著降低，类骨质减少（图1G-H）。免疫荧光显示SONFH修复前沿iNOS蛋白表达显著升高（图1I-J）。同时，SONFH中CD31⁺EMCN⁺ H型血管形成显著减少，血清和滑液中IL-6、IL-1β水平显著高于TONFH（图1K-N）。上述结果证实SONFH以全身炎症状态、成骨抑制和血管生成受损为特征。

图1. SONFH的全身炎症与骨形成受损。（A）SONFH患者与健康对照外周血清差异表达基因火山图（GEO: GSE123568）。（B）SONFH中炎症相关基因表达热图。（C）差异表达基因GO富集分析。（D）TONFH与SONFH股骨头标本代表性大体图像。（E）反应界面区micro-CT三维重建及彩色编码矿化分布图，红、绿、蓝分别代表低、中、高矿化密度，比例尺1 mm。（F）定量micro-CT参数。（G）Goldner三色染色显示成骨活性，箭头指示类骨质，比例尺100 μm（左）、20 μm（右）。（H）组织形态计量学定量。（I）iNOS（红色）与DAPI（蓝色）免疫荧光，比例尺500 μm（左）、100 μm（中）、20 μm（右）。（J）iNOS荧光强度定量。（K）EMCN（绿色）与CD31（红色）双标免疫荧光显示H型血管，比例尺50 μm（左）、5 μm（右）。（L）CD31与EMCN共定位定量。（M）患者血清炎症因子水平。（N）患者滑液炎症因子水平。

（2）GelMA/dECM@MnO₂-GA复合水凝胶的构建与表征

研究采用乳液界面氧化还原反应制备花状MnO₂纳米颗粒（直径约100 nm），通过静电吸附负载GA。将iPSC-dECM与MnO₂-GA分散于GelMA预聚液中，经冷冻干燥制备复合支架。SEM显示GelMA支架呈典型层状多孔结构，孔壁连续光滑；引入iPSC-dECM后层状结构保留，但孔壁变得皱褶粗糙，通道迂曲，结构复杂性增加（图2A）。TEM证实MnO₂为花状形貌，氮吸附-脱附实验表明其具有IV型等温线及H3滞后环，孔径主要集中在2–10 nm范围，比表面积大，为GA负载提供结构基础（图2B-C）。MnO₂纳米颗粒均匀分布于支架骨架表面，未破坏原有层状孔结构（图2D）。EDS元素mapping在dECM组仅检测到C、N、O、P峰，而复合支架组出现明显Mn特征峰（约6 keV），证实MnO₂成功载入（图2E-F）。FTIR显示酰胺I、II、III带，XRD检测到MnO₂（310）和（600）晶面特征衍射峰（图2G-H）。药物释放实验显示GA在24 h内释放约60%，随后进入缓释阶段；ICP-MS证实Mn²⁺释放具有H₂O₂浓度依赖性，呈现ROS响应性时序释放特征（图2I）。

图2.  GelMA/dECM@MnO₂-GA支架的表征与性质。（A）支架SEM图像，比例尺100 μm（左）、50 μm（右）。（B）花状MnO₂的SEM（上，比例尺750 nm/300 nm/150 nm）和TEM（下，比例尺1 μm/200 nm/100 nm）。（C）MnO₂氮吸附-脱附等温线及孔径分布插图。（D）GelMA/dECM@MnO₂-GA支架表面纳米颗粒SEM，比例尺1 μm。（E, F）dECM和GelMA/dECM@MnO₂-GA支架的EDS元素mapping，比例尺25 μm。（G）FTIR光谱。（H）XRD图谱。（I）GA释放曲线。

（3）复合水凝胶的体外抗氧化、细胞保护与促血管生成功能

将四种水凝胶分别与大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，并施加H₂O₂氧化应激。CCK-8与活死染色显示各组均具有良好的生物相容性，溶血率均低于5%（图3B-D）。DCFH-DA探针检测显示，GelMA/dECM@MnO₂和GelMA/dECM@MnO₂-GA组细胞内ROS水平显著降低，后者效果最佳（图3E-F）。功能实验表明，在氧化应激条件下，GelMA/dECM@MnO₂-GA组HUVECs在划痕实验和Transwell实验中的迁移能力最强（图3G-J），管形成实验显示其毛细血管样结构节点和环数量显著增加（图3K-L）。此外，凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）分析表明材料未引起明显凝血功能异常。上述结果证实复合水凝胶具有优异的生物相容性、抗氧化活性和内皮功能保护能力。

图3. 复合水凝胶清除ROS并增强内皮细胞活力与血管生成能力。（A）实验设计示意图。（B）rBMSCs与各组水凝胶共培养7天CCK-8检测（n = 4）。（C）HUVECs活死染色（绿色：Calcein-AM；红色：PI），比例尺100 μm。（D）死/活比例定量（n = 4）。（E）rBMSCs胞内ROS水平（绿色：DCFH-DA；蓝色：DAPI），比例尺200 μm。（F）ROS荧光强度定量（n = 4）。（G）HUVECs划痕实验24 h图像，比例尺200 μm。（H）迁移距离定量（n = 4）。（I）Transwell迁移实验图像，比例尺100 μm。（J）迁移细胞数定量（n = 4）。（K）Matrigel管形成实验图像，比例尺100 μm。（L）节点和环数量定量（n = 4）。

（4）复合水凝胶促进rBMSCs体外软骨内成骨分化

成骨诱导7天后，GelMA/dECM@MnO₂-GA组ALP活性显著高于对照组及单纯GelMA组（图4A-B）。14天时ARS染色显示该组钙结节沉积最丰富，基质矿化显著增强（图4C-D）。免疫荧光显示成骨标志物OSX（核）和OPN（胞浆）表达最强（图4E-F）。qRT-PCR表明，该组软骨细胞肥大标志物Col10a1、Ibsp及关键成骨基因Col1a1、Opn、Osx、Runx2均显著上调（图4G-H）。与rat tail I型胶原对照相比，iPSC-dECM developmental template更有效地促进了软骨内成骨相关分化。上述结果表明，复合水凝胶通过激活软骨内成骨样程序强效刺激rBMSCs成骨分化。

图4. 复合水凝胶通过软骨内成骨样途径促进BMSCs成骨分化。（A）成骨诱导7天ALP染色，比例尺1 mm（上）、200 μm（下）。（B）ALP活性定量（n = 3）。（C）成骨诱导14天ARS染色显示钙结节沉积，比例尺1 mm（上）、200 μm（下）。（D）ARS定量（n = 3）。（E）OSX和OPN免疫荧光，比例尺25 μm。（F）荧光强度定量（n = 3）。（G）肥大相关基因Col10a1和Ibsp的qRT-PCR（n = 3）。（H）成骨基因Col1a1、Opn、Osx和Runx2的qRT-PCR（n = 3）。

（5）复合水凝胶在大鼠SON骨缺损模型中促进骨再生与血管新生

采用LPS联合甲泼尼龙建立大鼠SON股骨缺损模型，分别于术后2周和4周进行评价。micro-CT显示，GelMA/dECM@MnO₂-GA组骨长入和矿化密度显著优于GelMA对照组，BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Ct.Th和Ct.Ar/Tt.Ar显著升高，Tb.Sp显著降低（图5B-D）。Micro-CT血管造影显示复合水凝胶组在4周时缺损区新生血管显著增多，最大增强信号显著升高（图5E-F）。Goldner三色染色显示，复合组2周和4周时成熟板层骨比例更高，纤维组织更少（图6A-D）。免疫组化显示缺损局部IL-1β、IL-6和TNF-α表达显著降低（图6E-F）。主要脏器H&E染色未见明显病理异常，提示系统安全性良好。与胶原对照水凝胶相比，GelMA/dECM@MnO₂-GA组新生骨面积显著更大，证实发育性dECM模板对 robust endochondral repair 的关键贡献。

图5. 复合水凝胶在类固醇诱导骨缺损模型中协同促进成骨与血管生成。（A）动物实验时间线示意图。（B）术后2周和4周缺损部位二维micro-CT图像。（C）三维重建micro-CT图像显示骨再生情况，彩色编码矿化密度分布。（D）定量micro-CT参数：BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、Ct.Th、Ct.Ar/Tt.Ar（n = 5）。（E）术后4周股骨远端micro-CT血管造影三维重建，比例尺3 mm（上）、1 mm（下）。（F）最大增强信号定量（n = 4）。

图6. 复合水凝胶增强体内骨形成并减轻局部炎症。（A）术后2周缺损区H&E和Goldner三色染色代表性图像，比例尺1 mm（上）、500 μm（下）。（B）2周骨组织面积定量（n = 5）。（C）术后4周H&E和Goldner三色染色，比例尺1 mm（上）、500 μm（下）。（D）4周骨组织面积定量（n = 5）。（E）术后4周缺损组织IL-1β、IL-6、TNF-α免疫组化染色，比例尺100 μm（左）、20 μm（右）。（F）IL-1β、IL-6、TNF-α阳性面积定量（n = 5）。

（6）转录组学与功能分析揭示免疫调节与成骨机制

对缺损区骨组织进行RNA-seq，PCA显示复合水凝胶组与对照组转录谱明显分离，生物学重复聚类良好（图7A）。差异表达分析发现416个上调基因和361个下调基因（图7B）。热图显示Runx2、Bmp4、Col1a1、Col1a2等成骨基因在复合组中高表达（图7C）。GO富集分析显示巨噬细胞活化参与的免疫应答、Treg分化、骨矿化等过程显著富集；KEGG分析提示细胞因子-细胞因子受体互作、cAMP信号通路和PI3K-AKT通路激活（图7D-E）。GSEA证实复合水凝胶抑制巨噬细胞活化及IL-1β、IL-6产生，并促进Treg分化（图7F-H）。体外巨噬细胞-水凝胶共培养实验中，复合水凝胶显著降低IL-1β和IL-6分泌，升高IL-4和IL-10水平（图7J）。流式细胞术证实其促进CD206⁺ M2极化、抑制CD86⁺ M1极化（图7K-L）。

图7. 转录组学与功能分析揭示复合水凝胶的免疫调节与成骨诱导机制。（A）RNA-seq数据PCA（n = 3）。（B）GelMA/dECM@MnO₂-GA与对照组差异表达基因火山图（n = 3）。（C）差异表达基因热图（n = 3）。（D）差异表达基因GO富集分析。（E）KEGG通路富集分析。（F-H）GSEA图：抑制巨噬细胞活化（F）、抑制IL-1β和IL-6产生（G）、促进Treg分化（H）。（I）体外巨噬细胞-水凝胶共培养示意图。（J）上清液细胞因子ELISA定量。（K）流式细胞术代表性散点图。（L）M1（CD86⁺）和M2（CD206⁺）巨噬细胞百分比定量（n = 4）。

（7）CCL22-CCR4-PI3K/AKT轴介导Treg招募与分化

基于转录组学提示的Treg参与，研究进一步解析其机制。将大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）与水凝胶-巨噬细胞共培养上清共培养，ELISA显示复合水凝胶组Treg极化细胞因子TGF-β1、IL-2及趋化因子CCL22显著升高（图8B-C）。流式细胞术证实CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ Treg比例显著增加（图8D-F）。HDOCK分子对接预测CCL22与CCR4以高亲和力稳定结合，结合自由能-94.75 kcal/mol（图8G-I）。siRNA沉默CCR4后，Treg关键基因Foxp3、Ctla4、Gitr、Il-10、Tgf-β1的上调被消除（图8J）。Western blot显示复合水凝胶激活PI3K/AKT信号，并上调下游FOXP3和IL-10蛋白表达（图8K-L）。上述结果表明，复合水凝胶通过M2巨噬细胞分泌CCL22，经CCR4-PI3K/AKT轴招募并促进Treg分化，形成M2-Treg正反馈环路，协同维持促再生免疫微环境。

图8. 复合水凝胶通过CCL22分泌及CCR4-PI3K/AKT信号驱动Treg分化。（A）体外细胞实验示意图。（B）上清液中Treg极化细胞因子TGF-β1、IL-2的ELISA定量（n = 3）。（C）趋化因子CCL22的ELISA检测。（D）CD4⁺FoxP3⁺CD25⁺ Treg流式细胞术代表性散点图。（E）CD4⁺ T细胞比例定量（n = 4）。（F）Treg频率定量（n = 4）。（G）HDOCK计算的CCL22（紫色）与CCR4（粉色）蛋白-蛋白对接模型。（H）CCL22-CCR4对接复合物表面展示。（I）PLIP分析的CCR4与CCL22相互作用。（J）siRNA沉默Ccr4后Treg相关基因Foxp3、Ctla4、Gitr、Il-10、Tgf-β1的qRT-PCR（n = 3）。（K）T细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、FOXP3、IL-10蛋白表达的Western blot。（L）Western blot条带灰度值定量（n = 3）。

（8）体内早期免疫微环境调控与H型血管形成

术后2周，免疫荧光显示复合水凝胶组iNOS⁺ M1巨噬细胞显著减少，Arg1⁺ M2巨噬细胞显著增加；该M2优势表型持续至4周（图9A-D）。Treg分析显示，2周时复合组CD4⁺FOXP3⁺ Treg细胞密度显著升高，但4周时与对照组无显著差异，提示Treg主要在早期炎症期发挥免疫调节作用（图9E-H）。同时，复合组CD31⁺EMCN⁺ H型血管形成显著增强（图9I-J）。这些结果证实，复合水凝胶通过早期M2极化、Treg富集及H型血管形成，建立了有利于软骨内成骨的局部再生微环境。

图9. 复合水凝胶在体内协调早期免疫调节并促进成骨耦合血管生成。（A）术后2周缺损区M1（iNOS⁺，绿色）和M2（Arg1⁺，红色）巨噬细胞免疫荧光，比例尺100 μm。（B）2周iNOS⁺和Arg1⁺细胞密度定量（n = 5）。（C）术后4周M1和M2巨噬细胞免疫荧光，比例尺100 μm。（D）4周定量（n = 5）。（E）术后2周Treg标志物CD4（绿色）和FOXP3（红色）免疫荧光，比例尺100 μm。（F）2周CD4⁺FOXP3⁺细胞密度（n = 5）。（G）术后4周Treg免疫荧光，比例尺50 μm。（H）4周Treg密度（n = 5）。（I）缺损区CD31（红色）和EMCN（绿色）双标免疫荧光显示H型血管，比例尺100 μm。（J）H型血管荧光强度定量（n = 5）。