（1）TA@TiO₂异质结声敏剂的制备与理化表征

研究人员采用纳米沉淀法将有机声敏剂TA、锐钛矿相TiO₂和DSPE-mPEG共同组装为水分散性的TA@ TiO₂杂化纳米颗粒（图1a）。质谱证实TA分子成功合成；XPS结果显示TiO₂以Ti⁴⁺为主，并含有典型的Ti-O晶格氧和表面羟基；XRD特征峰与锐钛矿相TiO₂标准卡片一致（图1b-e）。TEM显示TiO₂为长度约12 nm、宽度约2nm的棒状结构，组装后的TA@TiO₂呈边界清晰的球形颗粒，TiO₂主要被包载于杂化颗粒内部（图1f、g）。

DLS结果表明TA NPs和TA@TiO₂的水合粒径均约为25-30 nm，并可在不同pH缓冲液及RPMI-1640培养基中保持稳定。TA@ TiO₂的Zeta电位由TA NPs的约-27 mV升高至约-15 mV，进一步支持TiO₂成功引入（图1h、i）。两种纳米颗粒均在595 nm处表现出主要吸收峰，并在625 nm附近产生荧光发射；在相同TA浓度下，TA@ TiO₂的荧光强度约为TA NPs的2倍（图1j、k）。

图1. 有机-无机杂化声敏剂的合成与表征。a) TA@TiO₂合成示意图。b) 合成TA分子的MALDI-TOF MS谱图。c) TiO₂的高分辨Ti 2p XPS谱图。d) TiO₂的高分辨O 1s XPS谱图。e) TiO₂的XRD图谱，峰对应锐钛矿相（JCPDS no. 21-1272）。f) TiO₂的TEM图像。比例尺，100 nm。g) TA@TiO₂的TEM图像。比例尺，50 nm。h) TA NPs和TA@TiO₂在水中的动态光散射。i) TA NPs和TA@TiO₂在水中的表面zeta电位。j) TA NPs和TA@TiO₂在水中的吸收光谱。k) TA NPs和TA@TiO₂在水中的荧光光谱。

（2）TA@TiO2超声诱导发光性能的优化与超声穿透效果

为优化超声诱导发光，研究人员首先比较了不同表面活性剂。采用DSPE-mPEG制备的TA@TiO₂发光强度分别约为PSMA和F127体系的30倍和100倍，因此被用于后续研究（图2a、b）。在保持TA用量一致的条件下调节TiO₂掺杂量，当TA/TiO2质量比为4:1时发光最强，相比未加入TiO₂的体系提高约25倍（图2c、d）。进一步优化发现，1 MHz超声产生的发光强度约为3 MHz的100倍，较高占空比可获得更强输出，主要发光信号集中于570-770 nm范围（图2e-g）。

TA@TiO₂可被超声重复激活，单次激活后的发光可持续约35 min，发光半衰期约4 min（图2h-k）。此外，发光强度随超声功率升高而增加。以不同厚度鸡胸组织置于探头与样品之间后，随着组织厚度增加，超声能量传输效率及发光信号逐渐下降，但在8 mm组织覆盖条件下仍可检测到信号（图2l-p），表明该体系具有较高的超声响应灵敏度。

图2. TA@TiO₂超声诱导发光的优化及超声穿透效率研究。a) TA@TiO₂溶液超声诱导发光成像示意图。b) 不同表面活性剂制备的TA@TiO₂的超声诱导发光强度。c) 不同TiO₂含量TA@TiO₂的超声诱导发光图像。d) 图c对应的强度统计。e) 不同超声频率下TA@TiO₂的超声诱导发光强度。f) 不同超声占空比下TA@TiO₂的超声诱导发光强度。g) 不同通道下TA@TiO₂的超声诱导发光强度。h) 不同辐照周期下TA@TiO₂超声诱导发光图像（每次辐照后静置35 min再进行下一次）。i) 图h对应的强度统计。j) 单次辐照后TA@TiO₂超声诱导发光衰减图像。k) 图j对应的强度统计。l) 不同超声功率直接辐照下TA@TiO₂的超声诱导发光强度。m) 超声穿透鸡胸肉示意图。n) 不同厚度鸡胸肉覆盖下TA@TiO₂的超声诱导发光图像（超声功率1.5 W/cm²）。o) 图n对应的强度统计。p) 不同厚度鸡胸肉覆盖后的超声传输效率。

（3）TA@TiO₂增强超声发光、活性氧生成与散射介质穿透

在相同条件下，TA@TiO₂在照射时间、超声功率和材料浓度三个维度均明显优于TA NPs。TA@ TiO₂仅照射10 s时的发光强度已超过TA NPs照射30 s；其在0.6 W/cm²下的发光高于TA NPs在2 W/cm²下的输出；即使TA浓度降至0.625 μg/mL，发光强度仍超过10 μg/mL的TA NPs（图3a-g）。这些结果说明异质结的构建显著降低了获得可检测信号所需的超声剂量和材料用量。

ESR检测显示TA@TiO₂在超声下产生更强的·OH信号；DPBF结果表明，其总活性氧产率约为TA NPs的2.5倍（图3h-k）。在1%脂肪乳构建的光散射模型中，TA@TiO₂的信号在8 mm覆盖下仍保持清晰，而TA NPs在6 mm时已难以辨认；TA@TiO₂在不同厚度下的信背比总体约为TA NPs的2倍。即使先让超声穿过6 mm鸡胸组织再激活材料，TA@TiO₂仍表现出更优的发光穿透能力（图3l-q）。

图3. TA@TiO₂与TA NPs在超声诱导发光、ROS生成及组织穿透能力方面的比较。a) 超声诱导发光强度比较示意图。b) 不同超声时间下TA NPs和TA@TiO₂的超声诱导发光图像。c) 图b对应的强度统计。d) 不同超声功率下TA NPs和TA@TiO₂的超声诱导发光图像。e) 图d对应的强度统计。f) 不同TA浓度下TA NPs和TA@TiO₂的超声诱导发光图像。g) 图f对应的强度统计。h) 超声辐照后TA NPs和TA@TiO₂产生ROS的示意图。i) 超声辐照下TA NPs和TA@TiO₂在DMPO中的ESR谱图。j) 不同超声处理时间后DPBF与TA@TiO₂的紫外光谱变化。k) 通过监测418 nm处DPBF降解定量超声触发ROS产量。l) 单次超声辐照后TA@TiO₂和TA NPs穿透不同厚度1%脂肪乳的示意图。m) 不同厚度1%脂肪乳覆盖下TA@TiO₂和TA NPs的超声诱导发光图像。n) 图m对应的强度统计。o) 超声能量穿过6 mm鸡胸肉辐照TA@TiO₂和TA NPs，再穿透不同厚度1%脂肪乳的示意图。p) 不同厚度1%脂肪乳覆盖下的超声诱导发光图像。q) 图p对应的强度统计。

（4）TA@TiO₂促进电荷分离并触发活性氧介导的持续发光

TA和TiO₂的带隙分别约为1.94和3.26 eV，能带排列为界面电荷迁移提供了基础。超声空化与机械应变极化促进载流子分离，使TA导带中的电子向TiO₂迁移，减少电子-空穴复合；分离后的电子可参与氧还原反应，空穴则促进水氧化，从而放大活性氧生成（图4a-e）。电化学阻抗和超声触发电流进一步表明，TA/TiO₂界面具有更低的电荷转移阻力，其平均电流密度约为单独TA或TiO₂的1.4倍；TA@TiO₂产生的活性氧也高于等量TA NPs与TiO₂ NPs的物理混合物（图4f-h）。

超声处理后的TA中检测到·OH和¹O₂加合中间体EPO I与EPO II，说明活性氧可攻击TA并形成过氧化中间体；随后发生键断裂并释放化学能，进一步激发邻近TA分子产生持续发光（图4i）。外源·OH或¹O₂均可诱导TA发光，而缺氧或加入NaHCO3、TEMP等活性氧清除剂后，发光强度显著降低（图4j-p）。单纯升温至60 °C不能产生发光，排除了热激发为主要来源。上述结果证实，异质结增强的活性氧生成与TA的氧化化学转化共同构成了超声诱导发光机制。

图4. TA@TiO₂的ROS生成、ROS捕获及发光机制。a) TA@TiO₂的ROS生成、ROS捕获和发光机制示意图（下图为能带结构和电荷转移路径）。b) 从紫外-可见漫反射光谱计算TA分子能隙。c) 紫外光电子能谱测试TA分子价带能。d) 从紫外-可见漫反射光谱计算TiO₂能隙。e) 紫外光电子能谱测试TiO₂价带能。f) TA+TiO₂、TiO₂和TA的阻抗值。g) 连续超声辐照下TA+TiO₂、TiO₂和TA的超声电流。h) 超声辐照后TA NPs、TiO₂ NPs、TA NPs+TiO₂ NPs和TA@TiO₂组的ROS产量比较。i) 超声激发60 min后TA分子的MALDI-TOF-MS谱图。m/z为质荷比。j) 加入H₂O和·OH后TA NPs的化学发光强度。k) 加入H₂O、Na₂MoO₄、H₂O₂和¹O₂（Na₂MoO₄+H₂O₂）后TA NPs的化学发光强度。l) 常氧和缺氧条件下TA NPs的超声诱导发光强度。m) 不同浓度TEMP（¹O₂清除剂）和NaHCO₃（·OH清除剂）孵育后TA@TiO₂的超声诱导发光图像。n) 图m对应的强度统计。o) ROS清除剂浓度为10 mM时TA NPs和TA@TiO₂的超声诱导发光图像。p) 图o对应的强度统计。

（5）超声诱导发光强度可定量反映活性氧生成水平

由于TA@TiO₂的发光来源于活性氧介导的TA氧化反应，研究人员进一步验证该信号能否作为活性氧水平的光学读出。随着TA@TiO₂浓度由0.625 μg/mL增加至10 μg/mL，发光强度与活性氧产率同步升高，二者线性相关系数R²为0.97；改变超声照射时间后，两项指标也呈一致变化趋势，相关系数同样达到0.97（图5a-i）。在0-1.5 W/cm²的不同超声功率下，发光强度和活性氧产率均随功率增加而升高，相关系数为0.98（图5j-m）。将不同浓度、照射时间和功率条件下的数据合并后，整体相关系数仍达到0.95（图5n）。因此，TA@TiO₂的超声诱导发光可作为活性氧生成及声动力过程的间接反馈信号，为依据成像结果动态调整超声参数提供可能。

图5. TA@TiO₂超声诱导发光与ROS产量的关系。a) 不同条件下发光强度与ROS生成关系示意图。b) 不同浓度TA@TiO₂的超声诱导发光图像（按TA浓度计）。c) 图b对应的强度统计。d) 不同浓度TA@TiO₂超声辐照后的ROS生成。e) 不同浓度TA@TiO₂的超声诱导发光强度与ROS生成关系图。f) 不同辐照时间下TA@TiO₂的超声诱导发光图像。g) 图f对应的强度统计。h) 不同超声时间下TA@TiO₂的ROS生成。i) 不同辐照时间下TA@TiO₂超声诱导发光强度与ROS生成关系图。j) 不同超声功率下TA@TiO₂的超声诱导发光图像。k) 图j对应的强度统计。l) 不同超声功率下TA@TiO₂的ROS生成。m) 不同辐照功率下TA@TiO₂超声诱导发光强度与ROS生成关系图。n) 不同超声辐照条件下TA@TiO₂超声诱导发光强度与ROS生成的综合关系图。

（6）TA@TiO₂实现皮下及深部原位肿瘤的高对比度成像

将超声激活后的材料置于小鼠后肢下方时，TA@TiO₂的发光可穿透活体组织并持续检测约10 min，而TA NPs的信号在早期即明显衰减（图6a-c）。在4T1皮下肿瘤中，发光强度随超声功率、照射时间和材料浓度增加而增强；在所有参数条件下，TA@TiO₂组均获得更强的肿瘤信号（图6d-j），说明其在活体环境中仍保留了可调控的超声响应特性。在原位胶质瘤模型中，纳米颗粒经尾静脉注射4 h后对小鼠头部进行超声照射，TA@TiO₂在肿瘤区域产生的发光明显高于TA NPs；离体荧光成像显示材料在肿瘤所在脑区富集，脑组织H&E染色进一步确认了原位肿瘤的位置（图6k-n）。原位胰腺肿瘤解剖位置更深，且易受到周围器官遮挡。尽管如此，TA@TiO₂在各观察时间点仍产生比TA NPs更强的超声诱导发光，且信号随肿瘤内材料蓄积增加而增强；离体成像和胰腺组织H&E染色与活体信号位置一致（图6o-r）。这些结果表明，增强的超声诱导发光可提高小体积及深部原位肿瘤的成像对比度。

图6. TA@TiO₂和TA NPs的体内超声诱导发光成像。a) 小鼠皮下超声诱导发光成像示意图。b) 小鼠皮下放置超声辐照后的TA@TiO₂或TA NPs的成像。c) 图b对应的强度统计。d) 4T1皮下肿瘤超声诱导发光成像示意图。e) 不同超声功率下皮下肿瘤注射纳米颗粒后的发光图像。f) 图e对应的强度统计。g) 不同超声时间下皮下肿瘤注射纳米颗粒后的发光图像。h) 图g对应的强度统计。i) 不同浓度纳米颗粒皮下肿瘤注射后的发光图像。j) 图i对应的强度统计。k) 原位胶质瘤成像示意图。l) 尾静脉注射纳米颗粒后小鼠原位胶质瘤的超声诱导发光图像。m) 图l对应的强度统计。n) 脑切片H&E染色显示原位胶质瘤存在。比例尺，1 mm（左）和200 μm（右）。o) 原位胰腺肿瘤成像示意图。p) 尾静脉注射纳米颗粒后小鼠原位胰腺癌的超声诱导发光图像。q) 图p对应的强度统计。r) 胰腺切片H&E染色图像显示原位胰腺肿瘤存在。

（7）TA@TiO₂增强细胞及动物水平的声动力治疗效果

TA NPs和TA@TiO₂在最高100 μg/mL下均表现出较低的暗毒性。超声照射后，TA@TiO₂对4T1细胞的杀伤作用明显强于TA NPs，并随材料浓度和照射时间增加而增强（图7a-e）。DCFH-DA检测显示TA@TiO₂联合超声可产生更高的细胞内活性氧，加入活性氧清除剂后细胞活力部分恢复；Annexin V-FITC/PI流式结果进一步表明，TA@TiO₂联合超声组的细胞凋亡和坏死比例最高（图7f）。上述结果说明，异质结增强的活性氧通量可有效转化为更强的细胞杀伤效应。

在4T1皮下肿瘤模型中，研究人员比较了PBS、PBS联合超声、TA NPs瘤内注射联合超声、TA@TiO₂瘤内注射联合超声以及TA@TiO₂静脉注射联合超声。含声敏剂的治疗组均可抑制肿瘤生长，其中TA@TiO₂的疗效优于TA NPs，瘤内和静脉给药均显示出明显治疗作用（图7g）。肿瘤H&E染色显示，TA@TiO₂联合超声导致更显著的组织损伤（图7h），与其更高的活性氧生成和细胞杀伤结果一致。

治疗期间各组小鼠体重总体稳定，TA@TiO₂静脉给药联合超声后主要脏器未见明显组织学异常；溶血实验显示红细胞损伤较低，主要脏器中的Ti含量在注射后28 d逐渐下降。这些结果提示TA@ TiO₂在本研究条件下具有较好的初步生物安全性和体内应用潜力。

图7. TA@TiO₂在肿瘤细胞和皮下肿瘤中的声动力治疗。a) 4T1细胞中超声诱导发光和声动力治疗示意图。b) 不同浓度TA NPs和TA@TiO₂下4T1细胞的活力。c) 50 μg/mL纳米颗粒浓度下不同处理组4T1细胞的活力。d) 不同浓度TA NPs和TA@TiO₂超声辐照后4T1细胞的活力。e) 相同浓度TA NPs和TA@TiO₂不同超声时间下4T1细胞的活力。f) 超声处理后不同组4T1细胞凋亡和坏死的流式细胞术分析。g) 不同组的肿瘤生长曲线。h) 不同声动力治疗组超声辐照后肿瘤切片的H&E染色图像。