图1. 用于增强胶质母细胞瘤治疗的双前药纳米激活剂SPNFeD@Ang的设计。（a）SPN_FeD@Ang的合成路线示意图；（b）SPN_FeD@Ang介导的超声响应性铁死亡–焦亡级联及其协同治疗原位胶质瘤的机制示意图。

（1）SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD及SPN_FeD@Ang的制备与表征

如图2a所示，TEM结果显示，SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang均呈均一球形结构。动态光散射结果表明，SPN_FeD@Ang的水合粒径约为56.5 nm，略高于其他对照组，说明双前药负载及Ang修饰使颗粒尺寸增加（图2b）。SPN_FeD@Ang的Zeta电位约为-28.9 mV，与其他Ang修饰组相近，而未修饰Ang的SPN_FeD电位约为-23.3 mV，进一步证明了表面修饰对纳米颗粒界面性质的影响（图2c）。在光学性质方面，各组均在545 nm处呈现PFODBT的特征吸收峰，并在约700 nm处表现出相近的荧光发射峰，说明前药负载和表面修饰未明显改变半导体聚合物的光学特性；除SPN_FeD外，其他Ang修饰组在280 nm处均出现Ang特征吸收峰（图2d、e）。采用SOSG探针检测发现，超声照射后各组在528 nm处的荧光强度均随时间逐渐增强，照射10 min后约提高2.5倍，表明纳米颗粒具有稳定的单线态氧生成能力（图2f）。进一步采用·OH响应探针检测类Fenton反应，结果显示，含二茂铁前药的SPN_FeD@Ang在H₂O₂和超声共同作用下可显著促进·OH生成，而不含二茂铁前药的SPND@Ang未出现明显·OH信号，说明铁死亡相关氧化反应主要依赖二茂铁前药的参与（图2g）。此外，超声产生的ROS可切断DOX-TK前药中的硫缩酮键，从而促进游离DOX释放；酸性环境可进一步加速该过程，在pH 5.5条件下累计释放率超过90%。无超声刺激时药物释放较少，表明SPN_FeD@Ang具有良好的稳定性和超声响应性释放特征（图2h）。

图2. SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD及SPN_FeD@Ang的理化性质与超声响应性能。（a）SPNFe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang的TEM形貌表征；（b）各纳米颗粒的水合粒径；（c）各纳米颗粒的Zeta电位；（d）各纳米颗粒的紫外–可见吸收光谱；（e）各纳米颗粒的荧光发射特性；（f）采用单线态氧探针评价各纳米颗粒经超声处理后的声动力产¹O₂能力；（g）采用TMB检测SPN_FeD@Ang介导的铁死亡相关·OH生成，插图为不同处理组溶液照片；（h）SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang在pH 7.4及pH 5.5条件下，经超声或无超声处理后的DOX累积释放曲线。

（2）SPN_FeD@Ang的细胞摄取、体外抗肿瘤活性及作用机制

流式摄取实验显示，未修饰Ang的SPN_FeD摄取效率较其他组降低约1.5倍，而游离Ang预处理可竞争性抑制SPN_FeD@Ang的细胞摄取，证实其主要通过Ang-LRP-1介导的靶向内化进入胶质瘤细胞（图3a）。在超声和H₂O₂共同作用下，各纳米颗粒均表现出明显的细胞杀伤作用，其中SPN_FeD@Ang组细胞存活率最低，仅为26.1%，显示出最佳的协同治疗效果（图3b）。荧光成像结果表明，SPN_FeD@Ang可显著促进细胞内ROS积累，其荧光强度较对照组提高约14.3倍（图3c），说明超声诱导的¹O₂不仅可激活前药，还可进一步触发二茂铁介导的类Fenton反应，放大·OH生成。随后从LPO、GSH、MDA及相关蛋白表达等方面验证铁死亡。结果显示，含二茂铁前药的SPN_Fe@Ang、SPN_FeD及SPN_FeD@Ang组均表现出明显的脂质过氧化增强、GSH消耗及MDA升高，其中SPN_FeD@Ang组作用最为显著（图3d-f）。WB结果进一步显示，GPX4表达下调，而ACSL4表达上调，证实该体系可有效诱导铁死亡（图3g）。与此同时，焦亡相关蛋白检测显示，SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang组均出现GSDME-FL下降及GSDME-N升高，其中SPN_FeD@Ang组变化最明显（图3h）。加入铁死亡抑制剂后，GSDME-N生成受到抑制，说明铁死亡可作为上游放大环节进一步增强焦亡。细胞形态观察也显示，SPN_FeD@Ang组出现明显的细胞肿胀、膜起泡和膜破裂等焦亡特征（图3i）。最后，通过ATP释放、HMGB1释放和CRT外翻评价免疫原性细胞死亡。SPN_FeD@Ang联合超声和H₂O₂处理后，ATP和HMGB1水平分别提高约4.8倍和3.8倍，CRT荧光强度较未处理组增加约12.9倍（图3j-l）。

图3. SPN_FeD@Ang的体外抗肿瘤效果及铁死亡–焦亡协同机制。（a）流式细胞术分析SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang在GL261细胞中的摄取情况；（b）不同纳米颗粒在有无超声照射条件下对GL261细胞活力的影响；（c）荧光成像检测不同处理后GL261细胞内ROS生成；（d）荧光成像分析细胞内脂质过氧化（LPO）水平；（e）不同处理后GL261细胞内GSH含量；（f）细胞内MDA水平；（g）WB检测铁死亡相关蛋白GPX4和ACSL4的表达；（h）WB分析焦亡相关蛋白GSDME-FL和GSDME-N的表达；（i）不同处理后GL261细胞的焦亡形态变化；（j）细胞外ATP释放水平；（k）HMGB1释放水平；（l）CRT暴露的免疫荧光染色图像。

（3）SPN_FeD@Ang的血脑屏障穿越能力与原位胶质瘤富集

为评价纳米激活剂的血脑屏障穿越和胶质瘤靶向能力，首先检测了其在GL261胶质瘤细胞中的摄取情况。荧光成像结果显示，Ang修饰的SPNFe@Ang、SPND@Ang和SPN_FeD@Ang组均表现出更强的细胞内红色荧光，其荧光强度较未修饰Ang的SPN_FeD组提高约1.4倍，说明Ang可有效促进GL261细胞对纳米颗粒的靶向摄取（图4a）。在高表达LRP-1受体的bEnd.3脑微血管内皮细胞中，Ang修饰组的荧光信号同样明显增强，约为SPN_FeD组的2.3倍，证实其可通过Ang-LRP-1相互作用提高脑内皮细胞的识别和内化效率（图4b、c）。随后采用bEnd.3单层细胞构建体外Transwell血脑屏障模型。结果显示，Ang修饰的SPN_Fe@Ang、SPND@Ang和SPN_FeD@Ang能够更高效地穿过内皮细胞层，并被下室GL261细胞摄取，其荧光强度和细胞内化水平分别较SPN_FeD组提高约1.5倍和1.6倍，表明Ang修饰显著增强了纳米激活剂的血脑屏障穿透能力和跨屏障后的胶质瘤靶向性（图4d-f）。进一步在原位胶质瘤小鼠模型中评价体内富集效果。静脉注射后，各组纳米颗粒在24 h内均逐渐向肿瘤部位富集，但Ang修饰组的脑部荧光信号明显高于SPN_FeD组，24 h时约提高1.2倍（图4g、h）。离体脑组织成像同样显示，SPN_FeD@Ang等Ang修饰组在原位胶质瘤区域具有更强的荧光信号，进一步证明Ang可促进纳米颗粒穿越血脑屏障并实现胶质瘤靶向递送（图4i）。

图4. 纳米激活剂的血脑屏障穿越能力及原位胶质瘤富集。（a）荧光成像观察SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD和SPN_FeD@Ang在GL261细胞中的摄取情况；（b）不同纳米颗粒在bEnd.3脑微血管内皮细胞中的摄取分析；（c）bEnd.3细胞内荧光信号定量；（d）用于评价血脑屏障穿越能力的Transwell模型示意图；（e）下室GL261细胞中的荧光信号分析；（f）流式细胞术评价不同纳米颗粒穿过bEnd.3细胞层后被GL261细胞摄取的情况；（g）静脉注射不同纳米激活剂后，其在原位胶质瘤中的富集情况，黑色虚线圈标示肿瘤区域；（h）不同给药时间点胶质瘤区域荧光信号定量；（i）原位胶质瘤C57BL/6小鼠离体脑组织的代表性荧光图像及信号定量。

（4）SPN_FeD@Ang在原位胶质瘤模型中的治疗效果

为评价SPN_FeD@Ang的体内抗胶质瘤效果，研究人员构建了原位GL261-luc胶质瘤小鼠模型，并分别给予PBS、SPN_Fe@Ang、SPND@Ang、SPN_FeD或SPN_FeD@Ang处理，同时设置相应的超声照射组（图5a）。超声照射过程中，小鼠脑部温度始终维持在安全范围内，排除了明显热效应对治疗结果的干扰。活体生物发光成像显示，未接受有效联合治疗的各组肿瘤信号在14 d内持续增强，而SPN_Fe@Ang+US、SPND@Ang+US、SPN_FeD+US和SPN_FeD@Ang+US组的肿瘤生长均受到明显抑制，其中SPN_FeD@Ang+US组效果最显著，其生物发光信号较对照组降低约22.1倍（图5b、c）。体重变化结果显示，PBS及各无超声组小鼠体重逐渐下降，而接受纳米颗粒联合超声治疗的小鼠体重逐步恢复，提示其整体状态得到改善（图5d）。生存分析进一步表明，SPN_FeD@Ang+US组在30 d观察期内维持100%的生存率，而其他各组均出现不同程度死亡（图5e）。脑组织H&E染色结果显示，超声联合治疗组的颅内肿瘤面积明显减小，并出现广泛的肿瘤细胞坏死和死亡区域，其中SPN_FeD@Ang+US组肿瘤组织破坏最为显著（图5f）。

图5. SPN_FeD@Ang在原位胶质母细胞瘤小鼠中的抗肿瘤效果评价。（a）原位胶质瘤小鼠模型构建及纳米激活剂给药联合超声治疗方案示意图；（b）不同处理后第0、7和14天原位胶质瘤小鼠的生物发光成像结果；（c）原位胶质瘤区域生物发光信号定量；（d）不同处理组荷瘤小鼠体重变化；（e）各组原位胶质瘤小鼠累计生存率；（f）小鼠脑肿瘤组织的H&E染色图像，黑色圆圈标示肿瘤区域。

（5）SPN_FeD@Ang的体内抗胶质瘤机制

为阐明SPN_FeD@Ang的体内抗肿瘤机制，研究人员首先采用H₂DCFDA探针检测原位胶质瘤组织中的ROS水平。结果显示，纳米激活剂联合超声处理后均可显著增强肿瘤内氧化应激，其中SPN_FeD@Ang+US组ROS水平最高，较对照组升高约39倍（图6a）。进一步检测免疫原性细胞死亡相关指标发现，SPN_FeD@Ang+US组肿瘤内ATP水平提高约7.5倍，CRT暴露和HMGB1释放分别增强约17.6倍和12.0倍，说明铁死亡-焦亡协同可有效诱导强烈的ICD效应（图6b-f）。随后对铁死亡和焦亡机制进行验证。SPN_FeD@Ang+US处理使肿瘤内GSH降低至约0.2 μmol，同时MDA升高至约6.6 μmol/mg，表明抗氧化防御被破坏并伴随明显脂质过氧化（图6g、h）。Western blot结果显示，铁死亡相关蛋白GPX4显著下调，而ACSL4明显上调；与此同时，焦亡相关蛋白GSDME-FL减少，活化片段GSDME-N增加（图6i）。相比单独诱导焦亡的SPND@Ang+US组，SPN_FeD@Ang+US组的GSDME裂解更加显著，进一步证明铁死亡可作为上游放大环节促进焦亡。

图6. SPN_FeD@Ang在原位胶质瘤中的体内作用机制评价。（a）不同纳米激活剂在有无超声照射条件下处理后，原位胶质瘤小鼠肿瘤组织中ROS生成的荧光信号；（b）原位胶质瘤组织中ATP水平分析；（c）原位胶质瘤组织中CRT的免疫荧光染色图像；（d）CRT荧光强度定量分析；（e）原位胶质瘤组织中HMGB1染色图像；（f）HMGB1荧光强度定量分析；（g）肿瘤组织中GSH水平分析；（h）肿瘤组织中MDA相对含量分析；（i）原位胶质瘤组织中铁死亡和焦亡相关蛋白GPX4、ACSL4、GSDME-FL及GSDME-N的Western blot检测结果。

（6）SPN_FeD@Ang诱导的体内抗肿瘤免疫反应

为评价SPN_FeD@Ang诱导的抗肿瘤免疫效应，研究人员首先采用流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结和脾脏中的免疫细胞变化。结果显示，SPN_Fe@Ang+US、SPND@Ang+US、SPN_FeD+US及SPN_FeD@Ang+US均可促进树突状细胞成熟，其中SPN_FeD@Ang+US组成熟DC比例最高，达到30.2%，明显高于对照组的约9.4%（图7a）。同时，该组脾脏中CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞比例分别升高至52.3%和39.1%，而免疫抑制性Treg细胞比例下降至12.5%，表明铁死亡–焦亡级联能够有效激活外周抗肿瘤免疫并缓解免疫抑制（图7b-d）。进一步对脑肿瘤组织进行免疫荧光染色，结果显示，各纳米颗粒联合超声组均可促进CD4⁺和CD8⁺ T细胞向肿瘤内部浸润，其中SPN_FeD@Ang+US组的CD4荧光强度提高约29.5倍，并表现出最强的CD8⁺ T细胞浸润（图7e-h）。与此同时，该组肿瘤内Foxp3⁺ Treg细胞比例下降至3.6%，明显低于对照组的16.3%（图7i）。

图7. SPN_FeD@Ang诱导的体内抗肿瘤免疫反应。（a）不同处理后肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中成熟树突状细胞（DCs）的流式细胞术分析；（b）原位胶质瘤小鼠脾脏中CD3⁺CD4⁺ T细胞比例分析；（c）脾脏中CD3⁺CD8⁺ T细胞比例定量；（d）不同处理后脾脏中调节性T细胞（Treg）比例分析；（e）肿瘤切片中CD4的免疫荧光染色图像；（f）肿瘤组织中CD8的免疫荧光染色图像；（g）原位胶质瘤组织中CD4荧光强度定量；（h）肿瘤组织中CD8荧光强度定量；（i）原位胶质瘤组织中Foxp3染色的代表性图像。