（1）CNV病变及dNCL@tFNAs中NCL表达的表征

激光诱导的CNV小鼠模型中，Cy5标记的AS1411探针特异性蓄积于视网膜新生血管病变区域，且与CD31阳性新生血管共定位（图1a-c）。VEGF刺激可诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）NCL向细胞膜表面转位，膜蛋白免疫印迹证实膜定位NCL表达升高（图1d-f）。AS1411适配体可在3 h内被HUVECs摄取。通过点击化学反应将叠氮修饰的AS1411适配体与沙利度胺-O-氨基-丙炔（CRBN配体）偶联合成NCL靶向PROTAC（dNCL），非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实dNCL及阴性对照dCTRL（AS1411替换为乱序适配体）合成成功（图1g）。dNCL转染HUVECs可剂量和时间依赖性地诱导NCL降解，而直接加入培养基无此效应（图1h、i）。tFNAs与dNCL杂交形成dNCL@tFNAs，琼脂糖凝胶电泳证实偶联成功（图1j）；原子力显微镜显示tFNAs呈四面体结构，dNCL结合于四面体外部（图1k）；Zeta电位由-9.42 mV变为-13.10 mV（图1l）；动态光散射测得水合粒径由约11.78 nm增至19.61 nm（图1m）；血清稳定性较tFNAs显著增强（图1n、o）。

图1. CNV病变中NCL的表达及dNCL@tFNAs的表征。（a）小鼠眼球切片Cy5-AS1411（绿色）、抗CD31抗体（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光代表性图像，白色虚线指示CNV区域；（b）CNV区域Cy5-AS1411平均荧光积分密度定量；（c）CNV区域Cy5-AS1411（绿色）、抗CD31抗体（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光代表性图像；（d）VEGF（100 ng/mL）刺激或未刺激12 h的HUVECs非通透免疫染色抗NCL抗体和Hoechst代表性图像；（e）VEGF（100 ng/mL）刺激或未刺激12 h的HUVECs膜NCL蛋白印迹分析及（f）定量；（g）dNCL、tFNAs和dNCL@tFNAs逐步合成示意图；（h）转染或直接加入500 nM dNCL或dCTRL 24 h的HUVECs蛋白印迹分析及（i）定量；（j）琼脂糖凝胶电泳显示dNCL@tFNAs逐步构建过程；（k）tFNAs（左，白色箭头指示四面体结构）和dNCL@tFNAs（右，白色箭头指示dNCL@tFNAs，粒径增大表明dNCL负载于四面体结构）的原子力显微镜图像及示意图；（l）tFNAs和dNCL@tFNAs的Zeta电位；（m）tFNAs和dNCL@tFNAs的粒径分布；（n）tFNAs和dNCL@tFNAs血清稳定性琼脂糖凝胶电泳及（o）定量。

（2）dNCL@tFNAs 能高效进入内皮细胞并降解 NCL

dNCL@tFNAs的细胞摄取效率显著高于dNCL，1 h即出现快速高效摄取，且随时间延长更多dNCL@tFNAs进入HUVECs并逃逸溶酶体（图2a-d）。dNCL@tFNAs对HUVECs具有强靶向特异性，VEGF刺激下其内吞可由膜NCL介导（图2e、f）。体外RPE渗透模型中，dNCL@tFNAs组下层荧光强度显著高于dNCL组，提示其具有眼屏障穿透能力（图2g、h）。巨胞饮抑制剂EIPA可显著降低dNCL@tFNAs的细胞摄取，提示其内化可能与巨胞饮途径相关。dNCL@tFNAs直接加入培养基可剂量和时间依赖性地有效诱导NCL降解，包括VEGF刺激后的膜NCL（图2i-m）；该降解效应具有特异性，tFNAs和dNCL（直接加入）均无此作用（图2n、o）。蛋白酶体抑制剂MG132可阻断dNCL@tFNAs诱导的NCL降解，而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）无此作用，提示其主要通过蛋白酶体途径介导NCL降解（图2p、q）。

图2. dNCL@tFNAs穿透RPE屏障并进入内皮细胞降解NCL。（a）流式细胞术及（b）定量分析vehicle、dNCL和dNCL@tFNAs（250 nM）处理3 h后HUVECs的摄取；（c）流式细胞术及（d）定量分析不同时间点dNCL@tFNAs（250 nM）的细胞摄取；（e）流式细胞术及（f）定量分析dNCL@tFNAs（250 nM）处理3 h后HUVECs和ARPE-19细胞的摄取；（g）体外渗透实验示意图，上层为ARPE-19单层，下层检测不同时间点荧光强度以评价dNCL-Cy5和dNCL-Cy5@tFNAs的渗透性；（h）渗透性定量；（i）蛋白印迹分析及（j）定量显示不同时间点dNCL@tFNAs（50 nM）处理的HUVECs；（k）蛋白印迹分析及（l）定量显示不同浓度dNCL@tFNAs处理9 h的HUVECs；（m）dNCL@tFNAs与放线菌酮（CHX）联合处理指定时间点的HUVECs NCL蛋白印迹分析；（n）50 nM vehicle、tFNAs-SC、tFNAs、dCTRL、dCTRL@tFNAs-SC、dNCL和dNCL@tFNAs直接处理9 h的HUVECs蛋白印迹分析及定量；（o）上述各组处理的HUVECs免疫荧光代表性图像；（p）dNCL@tFNAs（50 nM）联合MG132（10 µM）处理9 h的HUVECs蛋白印迹分析及定量；（q）dNCL@tFNAs（50 nM）联合CQ（10 µM）处理9 h的HUVECs蛋白印迹分析及定量。

（3）dNCL@tFNAs 显著抑制体外血管生成

VEGF诱导的异常新生血管是湿性AMD的主要病理特征，其可促使NCL从细胞核转位至细胞膜表面，促进内皮细胞迁移、增殖和血管生成（图3a）。无VEGF刺激时，dNCL和tFNAs对HUVEC迁移无显著影响；VEGF刺激下dNCL可抑制细胞迁移，可能归因于VEGF促进NCL向细胞膜表面转位后增强的摄取（图3b、c）。dNCL@tFNAs在无VEGF刺激时即可显著抑制内皮细胞迁移，VEGF存在时抑制作用更强（图3b、c）。管腔形成实验证实dNCL@tFNAs在有或无VEGF刺激时均可显著抑制血管生成，且VEGF刺激条件下抑制作用更强（图3d-f）。EdU增殖实验显示相同趋势（图3g、h），表明dNCL@tFNAs对VEGF诱导的血管生成具有增强的抑制活性。

图3. dNCL@tFNAs显著抑制体外血管生成。（a）dNCL@tFNAs穿透血-视网膜屏障并降解CNV区域血管生成内皮细胞NCL的模式示意图；（b）VEGF（100 ng/mL）刺激或未刺激后vehicle、dNCL、tFNAs和dNCL@tFNAs（50 nM）处理24 h的HUVECs划痕愈合代表性图像及（c）迁移面积百分比定量；（d）上述各组处理9 h的HUVECs血管生成代表性图像及（e）管腔节点数和（f）连接点数定量；（g）上述各组处理9 h的HUVECs EdU掺入代表性图像及（h）EdU阳性细胞百分比定量。

（4）结膜下注射的 dNCL@tFNAs 穿透眼部屏障并在 CNV 病变处积聚

dNCL@tFNAs经滴眼液和结膜下注射两种非玻璃体腔途径给药后，6 h时结膜下注射组眼球荧光强度更高、药物损失更少，且荧光信号可持续至48 h，显示出更优的递送特征（图4a-d）。结膜下注射dNCL@tFNAs（2 μM，2 μL）后6 h即可在视网膜检测到Cy5荧光信号，随时间延长逐渐蓄积并持续至48 h，而dNCL组视网膜几乎无荧光信号，提示其无法穿透血-视网膜屏障（图4e）。激光诱导7天后，CNV模型小鼠和正常小鼠结膜下注射dNCL@tFNAs（2 μM，2 μL）6 h后，dNCL@tFNAs优先蓄积于CNV病变区域，与CD31阳性新生血管强共定位，正常小鼠视网膜及CNV模型小鼠非病变区域均无显著Cy5信号蓄积，表明dNCL@tFNAs对病理性新生血管具有优异的靶向特异性（图4f-h）。

图4. 结膜下注射的dNCL@tFNAs特异性蓄积于CNV区域。（a）滴眼液和结膜下注射给药途径示意图；（b）滴眼液和结膜下注射dNCL@tFNAs 6 h后小鼠眼球荧光图像及定量；（c）dNCL@tFNAs（2 μM）不同时间点处理的小鼠荧光图像及（d）定量；（e）结膜下注射dNCL-Cy5和dNCL-Cy5@tFNAs（2 μM）不同时间点小鼠眼底切片荧光代表性图像；（f）正常和CNV模型小鼠结膜下注射dNCL-Cy5和dNCL-Cy5@tFNAs（2 μM）6 h后眼底切片荧光代表性图像，放大区域白色箭头自上而下分别指示正常小鼠视网膜血管、CNV模型小鼠非病变区域和CNV病变区域；（g）dNCL-Cy5@tFNAs与CD31在正常视网膜血管中的共定位代表性荧光图像及（h）CNV血管中的共定位代表性荧光图像，各图右下角标注Pearson相关系数。

（5）dNCL@tFNAs 在体内表现出优异的抗血管生成活性，且无明显毒性

激光诱导CNV小鼠模型中，dNCL@tFNAs（2 μM，2 μL）结膜下注射可显著降低CNV病变高度和面积，效果与玻璃体腔注射康柏西普（2 μL）相当，而dNCL和tFNAs无此作用（图5a-d）；FFA显示dNCL@tFNAs和康柏西普均可显著减少CNV诱导的血管渗漏，dNCL和tFNAs则不能（图5e、f）；脉络膜铺片证实dNCL@tFNAs和康柏西普可显著减小CNV体积，dNCL和tFNAs无此效应（图5g-i）。

安全性评价方面，dNCL@tFNAs结膜下注射7天后，角膜荧光素染色、眼底照相、OCT成像、视网膜厚度分析、视网膜组织TUNEL染色、RPE-脉络膜组织炎症因子（IL-1β、IL-6、TNFα）检测及视网膜电图均未见明显毒性反应（图6a-j）；主要器官（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色无显著病理改变；血清AST、ALT和BUN水平均在正常范围内（图6k-m），表明dNCL@tFNAs具有良好的眼局部和全身安全性。

图5. dNCL@tFNAs抑制激光诱导的CNV。（a）激光诱导CNV小鼠给药方案示意图，分别行结膜下注射PBS、dNCL（2 μL，2 μM）、tFNAs（2 μL，2 μM）、dNCL@tFNAs（2 μL，2 μM）或玻璃体腔注射康柏西普（2 μL）；（b）CNV小鼠各病变区域OCT代表性图像，虚线指示CNV位置；（c）CNV厚度及（d）CNV面积定量；（e）CNV小鼠FFA代表性图像，虚线指示各病变区域；（f）血管渗漏面积定量；（g）CNV小鼠RPE-脉络膜铺片代表性图像，虚线指示各病变区域；（h）CNV体积及（i）NCL平均荧光积分密度定量。

图6. 结膜下注射dNCL@tFNAs的毒性评价。（a）vehicle、dNCL、tFNAs、dNCL@tFNAs或康柏西普处理1周后小鼠角膜荧光素染色代表性图像；（b）上述各组处理1周后小鼠视网膜明视野代表性图像；（c）上述各组处理1周后小鼠视网膜OCT代表性图像及（d）视网膜厚度定量；（e）上述各组处理1周后小鼠视网膜组织TUNEL染色；（f）IL-1β、（g）IL-6和（h）TNFα在RPE-脉络膜复合体中的含量；（i）上述各组处理1周后小鼠视网膜电图及（j）a波和b波振幅定量；（k）AST、（l）ALT和（m）BUN血清水平。