针对上述问题，厦门大学王少杰、方华攀教授联合研究团队开发了一种创新的生物活性平台。该平台将阿司匹林诱导的骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡与一种基于多面体低聚倍半硅氧烷的热响应水凝胶相结合，实现了对骨软骨缺损部位免疫微环境的精准调控与组织修复。研究团队利用阿司匹林预处理骨髓间充质干细胞，通过抑制COX-2/NF-κB炎症通路，赋予所分泌的细胞外囊泡独特的抗炎与促再生分子组成。随后将这些功能增强的细胞外囊泡负载于POSS基水凝胶中，该水凝胶具有优异的力学性能与生物相容性，能够在关节负载条件下实现细胞外囊泡的缓释与局部长期滞留。在体外与体内实验中，该系统显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖、迁移与软骨分化，并有效诱导M1型巨噬细胞向M2型极化。机制研究表明，Asp-EVs通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路，修复线粒体功能障碍，将巨噬细胞代谢从糖酵解重编程为氧化磷酸化，从而驱动抗炎表型转化。该文章于2026年3月23日以 《Aspirin-induced mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles promote osteochondral regeneration by reprogramming macrophages》为题发表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2026.124151）。

方案1. 负载Asp-EVs的POSS基水凝胶通过重编程巨噬细胞促进骨软骨再生的机制示意图

（1）细胞外囊泡的合成与表征

BMSCs在三维明胶微载体上培养（图1B），于第1、3、5、7天收集细胞评估活力。分别从非阿司匹林诱导（Ctrl-EVs）和阿司匹林诱导（Asp-EVs）的BMSCs中提取细胞外囊泡（图1A），透射电镜显示两种EVs均呈杯状膜结构（图1C），纳米颗粒追踪分析显示二者粒径分布相似（图1D），且阿司匹林处理提高了EVs产量。Western blot检测显示CD9、CD63、CD81和TSG101在Ctrl-EVs和Asp-EVs中高表达（图1E）。免疫荧光显示两种EVs均可被BMSCs和巨噬细胞内吞（图1F、1G），且内吞效率无统计学差异（P>0.05） 。

图1. EVs的合成与表征。(A) 示意图显示非阿司匹林诱导BMSCs来源的EVs（Ctrl-EVs）和阿司匹林诱导BMSCs来源的EVs（Asp-EVs）。(B) 示意图展示EVs的分离与纯化过程。(C) 通过透射电子显微镜（TEM）观察BMSCs来源EVs的形貌结构；标尺：100 nm。(D) 通过纳米颗粒追踪分析（NTA）分析BMSCs来源EVs的粒径分布。(E) 通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测CD63、TSG101、CD81和CD9的蛋白表达。(F) BMSCs对EVs的摄取；标尺：50 μm。(G) 巨噬细胞对EVs的摄取；标尺：10 μm。

（2）细胞外囊泡在体外和体内对巨噬细胞极化的影响

免疫荧光染色结果显示，Ctrl-EVs和Asp-EVs均能减少CD86+（M1型）细胞数量并增加CD206+（M2型）细胞数量，其中Asp-EVs的调节效果更为显著（图2A–C）。qRT-PCR分析证实，与LPS组相比，EVs处理组的M1型相关基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、INOS、CD86）表达水平降低，而M2型相关基因（CD206、IL-10、TGF-β、Arg-1）表达水平上调；Asp-EVs对炎症因子的抑制及对CD206、IL-10、TGF-β的提升作用均优于Ctrl-EVs（图2D–L）。ELISA检测结果进一步验证了Asp-EVs在下调IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达方面具有更高效率（图2M–Q）。流式细胞术结果同样明确了Asp-EVs处理后M1型巨噬细胞减少、M2型巨噬细胞增加的趋势（图2R–U）。此外，滑膜组织的免疫荧光染色结果表明，Asp-EVs在体内较Ctrl-EVs表现出更强的抗炎效应，显著促进了巨噬细胞从M1型向M2型的重编程（图2V–X）。

图2. EVs对巨噬细胞极化的体内外影响。(A) 巨噬细胞中CD86和CD206免疫荧光染色代表性图像；标尺：20 μm。(B–C) 巨噬细胞中CD206和CD86荧光强度的定量分析（n = 5）。(D–H) 通过qRT-PCR探究EVs对巨噬细胞促炎基因水平的影响（n = 3）。(I–L) 通过qRT-PCR分析EVs对巨噬细胞抗炎基因表达的影响（n = 3）。(M–Q) 通过ELISA检测EVs对巨噬细胞上清液中促炎和抗炎因子水平的影响（n = 3）。(R–S) 通过流式细胞术检测CD86⁺和CD206⁺巨噬细胞。(T–U) 通过流式细胞术定量分析CD86⁺和CD206⁺巨噬细胞比例（n = 3）。(V) 术后四周对滑膜组织中CD68⁺/CD86⁺/CD206⁺巨噬细胞进行免疫荧光分析。标尺：左图100 μm；右图50 μm。(W–X) 滑膜组织中CD68、CD86和CD206免疫荧光分析结果的定量分析（n = 5）。结果以均值±标准差表示。(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05，ns P > 0.05)。

（3）阿司匹林诱导的细胞外囊泡通过减轻M1型巨噬细胞介导的炎症微环境的抑制作用，增强骨髓间充质干细胞的软骨形成

通过收集M1型巨噬细胞条件培养基（M1φ-CM）模拟炎症环境，探究了Asp-EVs对骨髓间充质干细胞（BMSCs）成软骨分化的影响（图3A）。免疫荧光染色结果显示，M1φ-CM显著降低了Aggrecan、Col2a1及Sox-9的荧光强度，而Asp-EVs处理组的荧光强度较M1φ-CM组及Ctrl-EVs组明显升高，并恢复至对照组水平（图3B, D–F）。阿利新蓝、番红O及Col2a1免疫组化染色证实，M1φ-CM导致软骨陷窝样结构缺失及细胞外基质沉积减少，而Asp-EVs显著增加了陷窝结构数量、着色强度及Bern评分（图3C, G）。扫描电镜（SEM）分析进一步表明Asp-EVs改善了M1φ-CM导致的结构疏松问题。在基因层面，Asp-EVs显著上调了由炎症抑制的成软骨相关基因（Aggrecan、Col2a1、Sox-9及Runx-1）的表达，使其恢复至对照组水平（图3H–K）。上述结果表明，Asp-EVs可有效逆转M1φ-CM对BMSCs成软骨分化的抑制作用（图3A–K）。

图3. Asp-EVs通过缓解M1φ巨噬细胞介导的炎症微环境的抑制作用来增强BMSCs软骨形成。(A) Asp-EVs对M1-CM诱导炎症条件下BMSCs软骨分化影响的示意图。(B) 软骨形成相关蛋白（Aggrecan、Col2a1和Sox-9）表达的免疫荧光检测。标尺：50 μm。(C) 细胞团块中COL II的阿利新蓝、番红O及免疫组化染色。标尺：上图100 μm；下图25 μm。(D–F) BMSCs中Aggrecan、Col2a1和Sox-9荧光强度的定量分析（n = 5）。(G) 不同组组织学分析的Bern评分（n = 5）。(H–K) 软骨形成基因（Aggrecan、Col2a1、Sox-9和Runx-1）的RT-qPCR检测（n = 3）。结果以均值±标准差表示。(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05，ns P > 0.05)。

（4）mPOSS/PEG/PPG (mPEP) 共聚物的制备与表征

通过 ¹H NMR 光谱分析确认了 mPEP 共聚物水凝胶的化学结构（图 4A）：PEG 嵌段在 3.65 ppm 处显示 CH₂ 特征峰，PPG 嵌段在 1.14、3.54 和 4.2 ppm 处分别显示 CH₃、CH₂ 和 CH 峰，而 mPOSS 嵌段中异丁基的 CH₃ 和 CH₂ 特征峰分别出现在 0.96 和 0.6 ppm。扫描电镜（SEM）观察显示该水凝胶具有均匀分布的孔隙结构（图 4B）。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱进一步证实了有机-无机杂化结构的形成（图 4C），其中 1089-609 cm^-1 区域内的三个特征峰分别对应 Si-O-Si 不对称伸缩、环状硅氧烷单位中的对称伸缩以及 SiO₄ 四面体网络中的弯曲振动。X 射线光电子能谱（XPS）分析显示了 C 1s、N 1s、O 1s 和 Si 2p 的化学状态，其中 Si 2p 谱图中 102.5 eV 和 103.29 eV 处的峰位证实了 Si-O-C 及 Si-O 键的存在（图 4D-G）。动态光散射（DLS）结果表明，mPOSS 浓度显著影响孔径分布，高浓度 mPOSS 会导致孔径减小（图 4H）。流变学测试显示，增加 mPOSS 浓度可显著提升水凝胶的温度响应性、缩短成胶时间，并增强其机械性能与黏附力（图 4I-K）。综上，本研究成功构建了具有优异机械性能和黏附性的 mPEP 共聚物水凝胶系统。

图4. mPOSS/PEG/PPG（mPEP）共聚物的制备与表征。(A) mPOSS和mPEP（分别为蓝色和红色谱线）在CDCl₃中的¹H NMR谱图。(B) 通过扫描电子显微镜（SEM）确定mPEP共聚物水凝胶的内部结构。标尺：上图40 μm；下图5 μm。(C) mPEP共聚物水凝胶的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。(D–G) XPS数据揭示mPEP共聚物水凝胶中C、N、O和Si的含量分布。(H) 通过动态光散射（DLS）测定mPEP共聚物水凝胶的粒径。(I) 温度响应性、(J) 机械性能和(K) 不同浓度mPEP共聚物水凝胶的粘弹性通过流变学测定。

（5）骨软骨组织再生的大体、MRI 和显微 CT 图像

术后12周的大体观察显示，Blank组无软骨再生，Hydrogel组主要充填纤维组织；Hydrogel + Ctrl-EVs组虽有类软骨组织但边缘界限明显，而Hydrogel + Asp-EVs组缺损处平整且与周围组织良好整合（图5A）。ICRS评分证实，Hydrogel + Asp-EVs组在术后6周和12周的评分显著高于其他各组（图5B）。磁共振成像（MRI）结果与大体评估一致，Hydrogel + Asp-EVs组表现出光滑均质且无缝整合的新生软骨，其MRI WORMS评分明显占优（图5C-D）。在软骨下骨再生方面，Micro-CT分析显示，Blank组和Hydrogel组骨缺损持续存在或仅有少量薄骨小梁形成；Hydrogel + Ctrl-EVs组可见部分骨小梁但皮质缺损仍存；而Hydrogel + Asp-EVs组实现了髁间皮质骨的近乎完全愈合及显著的骨小梁再生（图5E-F）。定量分析表明，Hydrogel + Asp-EVs组的BMD、BV/TV及Tb.N数值最高，Tb.Sp数值最低，证实其具有最强的骨再生能力（图5G-J）。

图5. 骨软骨组织再生的大体观察、MRI及Micro-CT影像。(A) 术后6周和12周不同治疗组骨软骨缺损的大体观察（缺损区域由黑色圆圈标示；标尺：2 mm）。(B) 术后6周和12周不同治疗组的ICRS评分（n = 5）。(C) MRI显示骨软骨缺损修复情况（缺损区域由黄色圆圈标示；标尺：5 mm）。(D) 采用WORMS评分评估骨软骨组织修复质量（n = 5）。(E–F) Micro-CT成像显示术后6周和12周骨软骨缺损的二维及三维重建。标尺：2 mm。(G–J) 缺损区域骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和骨小梁数量（Tb.N）的定量分析（n = 5）。结果以均值±标准差表示。(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05)。

（6）新生骨软骨组织的组织学分析

通过 H&E、番红O-固绿、Masson 三色及天狼星红染色对骨软骨缺损区域进行组织学评估。术后 6 周，Blank 组与 Hydrogel 组骨重建不足且结构紊乱，而 Hydrogel + Asp-EVs 组已实现完全的骨重建并伴有初步的类软骨组织形成（图 6A）。术后 12 周，Blank 组和 Hydrogel 组虽有骨重建但表面多为纤维结缔组织；Hydrogel + Ctrl-EVs 组可见部分透明软骨样组织；相比之下，Hydrogel + Asp-EVs 组表现出近乎完全的缺损修复，软骨层排列整齐，新生组织厚度显著增加，并与周围组织无缝整合（图 6B）。番红O染色在 Hydrogel + Asp-EVs 组呈强阳性，且该组的 Wakitani 和 Seller 评分在术后 6 周和 12 周均优于其他各组，其修复效果在关键结构指标上与正常组（Sham）无统计学差异（图 6E–F）。免疫组化结果显示，术后 12 周 COL I 在 Blank 组和 Hydrogel 组中高表达，而 COL II 在 Hydrogel + Asp-EVs 组中表达水平最高，证实新生组织为透明软骨而非纤维软骨（图 6C，图 6G–H）。天狼星红染色及胶原排列分析表明（图 6C–D），Blank 组和 Hydrogel 组的胶原纤维多呈水平分布，符合纤维组织特征；而在 Hydrogel + Asp-EVs 组中，约 58% 的表层胶原纤维呈平行排列，约 68% 的深层胶原纤维呈垂直排列，其空间构象与天然软骨结构高度相似。

图6. 新生骨软骨组织的组织学分析。(A) 术后6周进行H&E、番红O-固绿（SO&FG）和马松（Masson）染色；标尺：200 μm。(B) 术后12周进行H&E、SO&FG和Masson染色；标尺：200 μm。(C) 术后12周通过免疫组化和天狼星红染色分析新生骨软骨组织中的胶原分布；标尺：上图200 μm，下图10 μm。(D) 对表面区（上三分之一）和底部区（下三分之二）胶原纤维的取向进行定量分析。(E–F) 计算改良Wakitani评分和Seller评分进行组织学评估（n = 5）。(G–H) 对COL I和COL II的表达进行定量分析（n = 5）。结果以均值±标准差表示。(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05)。

（7）阿司匹林诱导的细胞外囊泡通过调节线粒体活性促进了代谢重编程

通过对受Asp-EVs处理的M1型巨噬细胞进行RNA测序分析，热图和火山图结果显示，相比对照组，共有472个基因上调和299个基因下调（图7A, C）。KEGG通路富集分析表明，氧化磷酸化（OXPHOS）信号通路在Asp-EVs组中显著上调（图7B）；GSEA分析进一步证实，“线粒体大核糖体亚基”和“线粒体呼吸链复合物”相关的基因富集分数显著增加（图7E–F）。基因富集分析同时揭示了自噬相关差异表达基因的显著富集（图7D）。在线粒体功能方面，JC-1探针检测显示线粒体膜电位得到恢复，能量状态增强（图7G）；同时，Asp-EVs处理显著提升了ATP产量及线粒体呼吸链复合物I的活性（图7I, N）。透射电镜（TEM）观察证实线粒体形态得以修复且密度显著增加（图7H）。耗氧率（OCR）分析表明，Asp-EVs显著提高了细胞的基础呼吸、ATP生成能力和最大呼吸量（图7J–M）；胞外酸化率（ECAR）分析则显示其降低了基础及最大糖解能力（图7O–R）。上述结果表明，Asp-EVs通过改善线粒体形态与功能，促进了巨噬细胞从糖酵解向氧化磷酸化的代谢重组。

图7. Asp-EVs通过调控线粒体活性促进代谢重编程。(A) 热图显示PBS或Asp-EVs处理的M1φ巨噬细胞中显著差异表达基因的层次聚类。(B) 差异表达基因的KEGG分析。(C) 火山图揭示基因表达的上调和下调。(D–F) GSEA揭示Ctrl组和Asp-EVs组之间自噬、线粒体大核糖体亚基和线粒体呼吸链复合物的全局差异。(G) 免疫荧光染色显示巨噬细胞线粒体膜电位的代表性图像及荧光强度直方图；标尺：20 μm。(H) TEM图像显示巨噬细胞线粒体数量及结构；标尺：左图1 μm，右图2 μm。(I) 巨噬细胞ATP产量及(N) 线粒体呼吸链复合物I活性（n = 3）。(J–M) 检测氧消耗率（OCR），包括基础呼吸、ATP生成和最大呼吸（n = 3）。(O–R) 检测细胞外酸化率（ECAR），包括糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备（n = 3）。结果以均值±标准差表示。(*P < 0.001，P < 0.01，ns P > 0.05)。

（8）阿司匹林诱导的细胞外囊泡通过激活线粒体自噬调节巨噬细胞重编程，从而促进代谢重编程

qRT-PCR与Western blotting分析证实，自噬诱导剂（RAPA）可降低M1型标志物并提高M2型标志物表达，而自噬抑制剂（Baf1）具有相反作用，表明自噬水平显著影响巨噬细胞极化（图8C–F）。在M1型巨噬细胞中，LC3B、Beclin1蛋白水平及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路受到抑制，而Asp-EVs处理可逆转上述效应，并降低p-mTOR与P62的表达（图8A）。免疫荧光染色进一步确认，Asp-EVs恢复了M1型细胞中受损的LC3B与TOM20、LAMP1与TOM20的共定位，证实其通过PINK1/Parkin通路修复了线粒体自噬缺陷（图8B）。功能实验显示，Asp-EVs在减少M1表型、增加M2表型以及恢复线粒体膜电位（JC-1红绿荧光转换）方面的效力均优于RAPA，且该治疗效应可被Baf1部分抵消（图8C–G）。Seahorse实验结果表明，Asp-EVs能比RAPA更有效地提高基础呼吸、ATP产量及最大呼吸量，并降低糖解水平，而BafA1会削弱这一代谢重构作用（图8H–O）。综上，Asp-EVs通过激活线粒体自噬改善线粒体功能，进而驱动巨噬细胞从糖酵解向氧化磷酸化的代谢转变，促进M1型向M2型重编程。

图8. Asp-EVs通过激活线粒体自噬调控巨噬细胞重编程以促进代谢重编程。(A) EVs对巨噬细胞中mTOR、p-mTOR、Beclin、P62、Parkin、PINK1和LC3B蛋白水平的影响。(B) 巨噬细胞中LC3B、TOM20和LAMP1的代表性免疫荧光图像；标尺：5 μm。(C–F) 通过qRT-PCR检测巨噬细胞中M1φ相关基因（iNOS和CD86）及M2φ相关基因（ARG-1和CD206）的表达水平（n = 3）。(G) 巨噬细胞线粒体膜电位的代表性免疫荧光图像；标尺：20 μm。(H–K) 检测氧消耗率（OCR），包括基础呼吸、ATP生成和最大呼吸（n = 3）。(L–O) 检测细胞外酸化率（ECAR），包括糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备（n = 3）。结果以均值±标准差表示。(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05，ns P > 0.05)。