针对上述问题，浙江大学附属邵逸夫医院骨科陈键/赵凤东团队通过单细胞测序、条件基因敲除、多组学整合及临床样本验证，系统揭示了Pla2g7-Alox12/12-HETE/Gpr31-p38 MAPK-线粒体能量代谢轴在破骨细胞分化中的核心调控作用，并证实已处于III期临床试验的Darapladib可有效抑制骨丢失。该文章于2025年12月10日以《Pla2g7 regulates bone homeostasis via Alox12/12-HETE/Gpr31 signaling axis》为题发表于《Nature Communications》（Doi:10.1038/s41467-025-66285-8）。

（1）Pla2g7在人与小鼠骨组织中与骨吸收正相关

研究团队利用人骨组织单细胞RNA测序数据（GSE169396）进行UMAP降维分析，发现Pla2g7特异性富集于单核-巨噬细胞群体，在BMSC及其他免疫细胞中几乎不表达（图1A,B）。成骨细胞向骨细胞分化轨迹（GSE154718）显示Pla2g7无显著表达（图1C），而破骨细胞发育轨迹（GSE147174）揭示其在前破骨细胞及成熟破骨细胞中持续高表达（图1D,E）。RANKL诱导小鼠原代BMMs后，Pla2g7基因与蛋白水平呈时间依赖性上调（图1F,G）。免疫组化显示OVX小鼠股骨及K/BxN关节炎小鼠跖骨中Pla2g7表达显著升高，免疫荧光证实其高表达于Nfatc1+破骨细胞（图1H,I）。临床纳入150例受试者（正常骨量/骨质疏松各75例），ELISA检测显示骨质疏松患者血清PLA2G7水平显著高于正常组，且与骨吸收标志物CTX-1正相关，与骨形成标志物PINP无显著关联（图1J）；小鼠OVX模型中Pla2g7同样与CTX-I正相关、与PINP负相关（图1K）。上述结果一致表明Pla2g7与骨吸收密切相关。

图1. Pla2g7上调与骨丢失关联。（A,B）单细胞测序显示Pla2g7在破骨细胞中高表达；（C）骨细胞分化过程中表达变化；（D-G）RANKL诱导下破骨细胞中Pla2g7、Nfatc1和c-Fos时间依赖性上调，n=3；（H,I）OVX及K/BxN模型Pla2g7阳性细胞增加，n=6；（J）OP患者血清Pla2g7高于NP，n=75；（K）OVX小鼠血清Pla2g7升高，n=6。数据以mean±SD表示，采用t检验或单因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（2）破骨细胞特异性敲除Pla2g7显著增加小鼠骨量并挽救OVX诱导骨丢失

团队构建Pla2g7破骨细胞谱系特异性条件敲除（cKO）模型，Micro-CT显示12周龄Pla2g7LysM及Pla2g7CTSK雌性小鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著升高，Tb.Sp降低，皮质骨厚度无变化（图2A-C）；HE与TRAP染色及形态计量学证实破骨细胞数量减少，Oc.N/BS与Oc.S/BS下降（图2D-G），血清CTX-I降低而PINP无变化（图2H,I），体长及后肢长骨长度正常（图2J）。OVX模型中，Pla2g7缺失显著挽救骨量丢失，BV/TV、Tb.Th、Tb.N升高而Tb.Sp降低（图2K-N），破骨细胞形成减少但皮质骨参数无变化。综上，Pla2g7缺失通过抑制破骨细胞介导的骨吸收增加骨量。

图2. 破骨细胞特异性敲除Pla2g7增加小鼠骨量。（A-C）Pla2g7LysM及Pla2g7CTSK雌性小鼠BV/TV、Tb.Th、Tb.N升高，Tb.Sp降低，n=6；（D-G）破骨细胞数量及Oc.N/BS、Oc.S/BS下降，n=6；（H,I）血清CTX降低，PINP无变化，n=6；（J）体长及后肢长度正常；（K-N）Pla2g7缺失显著挽救OVX诱导骨量丢失，n=6。数据以mean±SD表示，采用t检验或双因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（3）Darapladib作为Pla2g7特异性抑制剂有效抑制破骨细胞分化

团队分离Pla2g7LysM及WT小鼠原代BMMs，TRAP与F-actin染色显示Pla2g7LysM组破骨细胞分化显著受抑，标志物表达及骨吸收活性降低（图3A-D）。已完成II/III期临床试验的Pla2g7抑制剂Darapladib（图3E）以浓度依赖方式强效抑制破骨细胞分化（图3F,G），Nfatc1、c-Fos及Ctsk表达降低（图3H-J），骨侵蚀面积显著减少（图3K,L）；外源重组Pla2g7蛋白则显著促进破骨细胞分化、标志物表达及骨板侵蚀（图3M-P）。Darapladib与重组蛋白对成骨细胞分化均无影响。上述结果证实Pla2g7/Darapladib特异性调控破骨细胞分化。

图3. Darapladib或Pla2g7对破骨细胞生成的影响。（A-D）Pla2g7LysM组破骨细胞分化受抑，标志物表达降低，n=6/3；（E）Darapladib分子结构；（F,G）Darapladib浓度依赖性抑制破骨细胞分化，n=6；（H-J）标志物表达下调；（K,L）骨吸收活性降低，n=3；（M-P）重组Pla2g7促进破骨细胞分化及标志物表达。数据以mean±SD表示，采用t检验、单因素或双因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（4）多组学整合揭示花生四烯酸代谢为Pla2g7调控破骨细胞分化的核心下游通路

团队对Darapladib处理组进行脂质组学分析，PCA显示两组脂质谱显著分离，鉴定出401个差异代谢物（135个上调，266个下调），前十差异代谢物半数与花生四烯酸代谢相关，FA 20:4显著降低（图4A-D）；KEGG分析显示脂质代谢为最显著富集通路，花生四烯酸代谢高度富集。RNA测序鉴定出1036个上调与1979个下调DEGs，破骨细胞相关基因降低（图4E-G），花生四烯酸代谢选择性富集（图4H）。ELISA确认Darapladib处理及Pla2g7LysM、Pla2g7CTSK组花生四烯酸浓度均降低（图4I,J）。尽管Pla2g7可重塑脂质代谢抵抗铁死亡，但本研究中Darapladib或Pla2g7敲除抑制破骨细胞铁死亡通路，外源Pla2g7增强之，提示Pla2g7通过独立于铁死亡的机制调控破骨细胞分化（图4K-M）。

图4. Darapladib通过调控花生四烯酸代谢抑制破骨细胞分化。（A-D）脂质组学显示Darapladib处理后FA 20:4显著降低，n=5；（E-G）RNA-seq鉴定3015个DEGs，破骨细胞基因下调，n=3；（H）KEGG分析花生四烯酸代谢选择性富集；（I,J）Darapladib及Pla2g7 cKO组花生四烯酸浓度降低，n=4；（K-M）铁死亡相关蛋白表达变化提示Pla2g7通过独立于铁死亡的机制调控破骨细胞分化，n=3。数据以mean±SD表示，采用双尾Student's t检验。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（5）Alox12/12-HETE信号轴介导Pla2g7增强的破骨细胞分化

团队筛选花生四烯酸代谢关键酶发现，Darapladib处理或Pla2g7敲除后Alox12变化最显著，重组Pla2g7蛋白则上调Alox12（图5A-D），免疫荧光证实该调控（图5E,F）；OVX模型中Darapladib及cKO组破骨细胞分化与Alox12表达均降低（图5G,H）。外源花生四烯酸可恢复Alox12表达，提示其下调由花生四烯酸可用性降低介导。Alox12抑制剂ML355显著抑制Pla2g7增强的破骨细胞形成及标志物表达（图5I-K），时间梯度实验进一步验证（图5L）；而Alox5抑制剂轻微促进分化，COX抑制剂部分抑制，Alox15及CYP450抑制剂无显著效应。Darapladib处理后Alox12产物12-HETE显著降低（图5M），外源12-HETE可促进破骨细胞分化并部分挽救Darapladib或Pla2g7敲除的抑制效应（图5N,Q,R）。综上，Alox12/12-HETE信号轴参与Pla2g7调控的破骨细胞分化。

图5. Darapladib通过Alox12/12-HETE轴抑制破骨细胞形成。（A-D）Darapladib或Pla2g7敲除后Alox12变化最显著；（E,F）Darapladib降低破骨细胞Alox12表达，n=3；（G,H）体内验证Alox12与Nfatc1共表达降低，n=6；（I-L）ML355阻断Pla2g7诱导的破骨细胞分化，n=3；（M）Darapladib降低12-HETE浓度，n=4；（N-R）外源12-HETE挽救Darapladib抑制的破骨细胞分化及标志物表达。数据以mean±SD表示，采用t检验或双因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（6）Pla2g7/12-HETE/Gpr31轴通过p38 MAPK与线粒体能量代谢介导破骨细胞分化

团队发现Gpr31（12-HETE受体）敲低显著下调破骨细胞标志物，抑制破骨细胞分化（图6A-D），且抑制12-HETE及Pla2g7诱导的破骨细胞生成。转录组分析显示Darapladib处理后MAPK信号及氧化磷酸化高度富集（图6E），GSEA证实两者均被抑制（图6F）；p38 MAPK信号被Pla2g7抑制/缺失及Gpr31敲低所抑制，Pla2g7刺激则增强之（图6G,H）。Seahorse实验显示Darapladib处理及Pla2g7缺失显著降低RANKL诱导的ATP偶联呼吸、最大呼吸（图6I,J）及最大ECAR（图6K），Gpr31敲低结果一致（图6M-P）。线粒体呼吸链蛋白（Cyc1、Uqcrc2、Ndufs6）在Pla2g7刺激后上调，抑制/敲除及Gpr31敲低后下调（图6Q-S）；线粒体动力学显示Pla2g7抑制/缺失及Gpr31敲低组分裂减少、融合增加（图6T-V），伴随ROS与mtROS降低（图6W-Z）。p38 MAPK抑制剂与激活剂进一步验证OCR、氧化磷酸化、电子传递链活性、线粒体动力学及mtROS等系列实验，支持p38 MAPK为Pla2g7/Gpr31下游效应器。综上，Pla2g7/12-HETE/Gpr31轴通过调控p38 MAPK信号与线粒体能量代谢介导破骨细胞分化。

图6. Darapladib与Gpr31通过p38 MAPK和线粒体能量代谢介导破骨细胞分化。（A,B）Gpr31 siRNA敲除效率验证，n=3；（C,D）Gpr31敲低抑制破骨细胞分化；（E,F）Darapladib处理后MAPK与氧化磷酸化通路富集；（G,H）Gpr31敲低或Pla2g7抑制抑制p38 MAPK；（I-P）Darapladib或Gpr31敲低降低OCR、ECAR及最大呼吸，n=3；（Q-S）呼吸链蛋白表达下调；（T-V）线粒体分裂减少、融合增加；（W-Z）ROS与mtROS降低，n=3。数据以mean±SD表示，采用t检验、单因素或双因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（7）Darapladib有效改善高脂饮食、OVX及急性炎症诱导的多种病理骨丢失

团队构建HFD小鼠模型，Darapladib（20 mg/kg，隔日腹腔注射，3个月）显著降低体重、肝脏重量及TG、TCHO、LDL-C等脂质指标，减少肝脏脂质形成；Micro-CT显示其挽救HFD诱导的骨量丢失，BV/TV、Tb.N及Tb.Th改善（图7A-C），HE与TRAP染色证实破骨细胞形成减少（图7D,E），但皮质骨参数无变化（图7F,G），OCN免疫荧光显示对成骨细胞无影响。OVX模型中，Darapladib显著改善骨质疏松，BV/TV、Tb.N及Tb.Th升高（图7H-J），破骨细胞生成有效减少（图7K,L），皮质骨与OCN免疫荧光无显著差异（图7M,N）。LPS颅骨下注射模型中，Darapladib（20 mg/kg，2周）显著减少骨溶解与破骨细胞数量。综上，Darapladib在多种病理模型中有效抑制骨丢失。

图7. Darapladib改善HFD与OVX模型骨丢失。（A）HFD模型示意图；（B,C）HFD+Darapladib组BV/TV、Tb.N、Tb.Th较HFD组改善，n=6；（D,E）该组破骨细胞减少，n=6；（F,G）皮质骨参数无显著变化，n=6；（H）OVX模型示意图；（I,J）OVX+Darapladib组骨量较OVX组升高，n=6；（K,L）破骨细胞生成有效减少，n=6；（M,N）皮质骨无显著差异，n=6。数据以mean±SD表示，采用双因素方差分析。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。

（8）PLA2G7作为人类骨质疏松潜在治疗靶点的临床验证

团队收集16例骨质疏松与16例正常骨量患者松质骨样本，免疫组化显示骨质疏松组PLA2G7阳性细胞数显著增加（图8A,B），免疫荧光证实PLA2G7阳性多核破骨细胞高表达（图8C,D），蛋白与mRNA检测验证PLA2G7表达高于对照组（图8E,F）。健康供体hPBMCs经RANKL诱导后PLA2G7呈时间依赖性升高（图8G）；Darapladib（400 nM）有效抑制人破骨细胞分化，重组PLA2G7蛋白（200 ng/mL）增强分化能力（图8H,K），Western blot与RT-qPCR结果一致（图8I,J,L,M）。ALP与ARS染色及免疫印迹表明两者对人MSC成骨分化均无影响（图8N-P及图8O,Q）。综上，PLA2G7在人与小鼠中均调控破骨细胞分化，Darapladib具有骨质疏松临床治疗的潜在应用价值。

图8. PLA2G7作为骨质疏松潜在治疗靶点。（A,B）OP组Pla2g7免疫组化阳性细胞数显著高于NP组，n=16；（C,D）OP组Pla2g7+NFATc1+破骨细胞高表达，n=6；（E,F）OP组Pla2g7 mRNA与蛋白表达升高；（G）人破骨细胞分化中Pla2g7时间依赖性上调；（H-K）Darapladib（400 nM）抑制而重组Pla2g7（200 ng/mL）促进人破骨细胞分化；（L,M）相应组破骨细胞标志物表达变化；（N-Q）两者对人MSC成骨分化均无显著影响。数据以mean±SD表示，采用双尾Student's t检验。显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001，ns无显著性。