针对上述问题，南方医科大学珠江医院史福军团队开发了一种肿瘤微环境响应性的喜树碱肽偶联物纳米组装体，用于将SLC7A5抑制剂JPH203原位递送至TNBC。该平台整合三个功能域：喜树碱作为疏水核心驱动自组装并诱导线粒体功能障碍；基质金属蛋白酶可切割的连接子实现肿瘤特异性解聚；RGDS靶向肽介导肿瘤细胞归巢。静脉给药后形成稳定胶束，在肿瘤部位酶切触发解离，释放JPH203抑制亮氨酸摄取和mTORC1信号，耗竭谷胱甘肽并损害GPX4活性；同时增强喜树碱滞留导致线粒体功能障碍和活性氧爆发。这种协同破坏引发强效铁死亡，激活抗肿瘤免疫。在原位模型中实现81.2%肿瘤抑制率，显著改善生存结局，具有良好的生物安全性。该文章于2026年3月14日以《In situ delivery of JPH203 via camptothecin-peptide conjugate nanoassemblies to trigger ferroptosis in triple-negative breast cancer》为题发表于《Journal of Controlled Release》（DOI：10.1016/j.jconrel.2026.114829）。

研究示意图

（1）SLC7A5与 TNBC 中不良预后及铁死亡调控密切相关

差异表达分析发现TNBC与健康对照间存在7917个DEGs（图1a），其中271个与铁死亡基因集重叠（图1b）。GO/KEGG富集分析证实这些基因在"氧化应激反应""脂质过氧化"等铁死亡相关通路显著富集（图1c-d）。LASSO回归确定最优lambda值（图1e），系数路径图展示基因收缩轨迹（图1f）。SLC7A5因高正值系数及TNBC中显著上调被选为关键候选基因（图1g），其在各乳腺癌亚型中均过表达且TNBC最高（图1h），并与铁死亡抑制特征正相关（图1i）。TCGA队列生存分析显示SLC7A5高表达患者OS和DFS显著缩短（图1j-k），THPA的IHC数据进一步验证（图1l）。scRNA-seq揭示SLC7A5及其旁系同源基因SLC7A11在不同肿瘤细胞群体中的异质性表达（图1m-p）。分子机制上，JPH203抑制SLC7A5显著降低抗铁死亡蛋白表达（图1q），增加胞内铁及MDA水平，该效应可被Fer-1逆转（图1r-s），证实SLC7A5是TNBC中维持铁死亡抵抗的强效预后标志物及治疗靶点。

图1.TNBC 中铁死亡相关SLC7A5的生物信息学分析及相关性验证。（a）基于GEO数据库数据绘制的差异表达基因火山图；（b）维恩图；（c）GO富集分析气泡图；（d）KEGG富集分析气泡图；（e）Lasso交叉验证误差图；（f）Lasso系数路径图；（g）对数FC表达值柱状图；（h）基于TCGA数据比较不同乳腺癌亚型中SLC7A5表达差异；（i）散点图；（j、k）生存分析；（l）IHC染色；（m-p）单细胞RNA测序分析；（q）蛋白质印迹分析；（r，s）相对铁含量与丙二醛含量。

（2）CPCs- JPH 的设计与表征

CPCs形成了稳定的纳米组装体，激光照射下显著的廷德尔效应证实了胶体分散体的形成（图2a）。 HPLC分析证实了连接子的特异性酶解作用（图2b）。经明胶酶处理的CPCs证实了由手性超分子组装产生的激子耦合现象（图2c）。这些纳米组装体表现出约162 nm的流体动力学直径，经明胶酶处理后该直径进一步降至约57 nm（图2d）。完整的CPCs和CPCs- JPH 呈现为球形纳米颗粒，而经酶处理的样本则显示出碎片化和聚集结构，这与酶切诱导的结构崩解一致（图2e-g）。在非酶促条件下，JPH203的累积释放量在120小时内仅达到约20%，而在明胶酶存在时则激增至70%以上（图2h）。CLSM 图像显示存在时间依赖性内化现象：荧光强度从0小时至4小时逐渐增强， NBD 信号在胞质中弥散分布并伴有核周聚集（图2i和2j）。流式细胞术定量分析显示荧光阳性细胞比例从0小时的9.31%上升至4小时的82.7%（图2k和2l）。

（3）CPCs- JPH 通过破坏铁代谢和氧化还原稳态，在 TNBC 中触发铁死亡

分析显示，在SLC7A5高表达肿瘤中铁死亡通路基因特征显著富集（图3a），提示可通过抑制SLC7A5利用潜在治疗弱点。从机制上讲，从结合物中释放的 JPH203 有效抑制了 SLC7A5 介导的亮氨酸摄取，并且在所有处理条件中，CPCs-JPH 组的亮氨酸浓度最低（图 3d和3e）。蛋白质印迹法及定量分析表明，含JPH203的处理组显著抑制了mTOR（磷酸化mTOR，p-mTOR）的磷酸化水平，这与mTORC1抑制作用一致（图3f和3g）。CLSM 成像与定量分析显示，含JPH203组中铁蛋白重链1（FTH1）和铁转运蛋白1（FPN1）表达显著下调，其中CPCs- JPH 处理组的降低最为明显（图3h和3i）。铁调节功能的双重受损导致不稳定的 Fe2+大量蓄积，这通过增强的FerroOrange荧光信号得以直观呈现（图3j和3k），并通过总细胞铁含量定量分析得到证实（图3l和3m）。经CPCs- JPH 处理的细胞中GPX4蛋白水平显著降低（图3n和3o）。此外，生化检测表明 GSH 含量明显减少且GPX4活性降低（图3p和3q）。研究结果表明，CPCs- JPH 通过协同破坏铁稳态并抑制SLC7A5以失活 GSH -GPX4抗氧化轴，从而驱动 TNBC 发生铁死亡（图3r）。

图3.CPCs-JPH介导的铁和氧化还原稳态破坏。（a）GSEA显示铁死亡通路在SLC7A5高表达乳腺癌样本中富集；（b、c）各处理组4T1细胞活力的定量分析；（d）不同浓度JPH203处理后4T1细胞亮氨酸水平；（e）各处理组4T1细胞亮氨酸水平的定量分析；（f、g）mTOR和p-mTOR的蛋白质印迹及定量分析；（h、i）FTH1和FPN1的代表性CLSM图像及定量分析；（j、k）FerroOrange的代表性CLSM图像及定量分析；（l、m）各处理组4T1细胞铁含量的定量分析；（n、o）GPX4的代表性CLSM图像及定量强度分析；（p、q）GSH和GPX4活性的定量分析；（r）CPCs-JPH通过抑制SLC7A5诱导铁死亡的机制图。

（4）CPCs- JPH 通过阻断药物外排并诱导线粒体功能障碍来增强铁死亡

如图4a-c所示， CLSM 成像、三维表面图及流式细胞术分析表明，在所有治疗组中，CPCs- JPH 诱导的P-gp表达下调最为显著。该抑制作用通过Rho-123外排实验得到功能验证（图4d-g）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，经CPCs- JPH 处理的4T1细胞出现线粒体收缩、膜密度增加以及嵴结构缺失或碎裂（图4h）。与这些结构损伤一致， CLSM 成像表明线粒体超氧化物生成活跃（图4i）。此外， CLSM 与定量分析证实CPCs- JPH 处理后细胞色素c（Cyt c）从线粒体向细胞质发生显著转位（图4j和4k）。CLSM 成像显示CPCs- JPH 处理组细胞中红色聚集体向绿色单体发生显著转变（图4l）。流式细胞术定量分析证实，CPCs- JPH 组线粒体去极化4T1细胞比例高达近50%，远超其他制剂组效应（图4m和4n）。同时，基于 DCFH -DA的 CLSM 与流式细胞术分析反映了细胞内活性氧（ROS）总量激增（图4o-q）。CLSM 成像与流式细胞术检测均显示，经CPCs- JPH 处理的细胞中氧化信号强度显著增强（图4r-t）。与所有对照组及比较组相比，CPCsJPH组的MDA水平显著升高（图4u）。综合结果表明，CPCs- JPH 介导的CPT外排阻断作用与mTORC1抑制诱导的严重线粒体功能障碍产生协同效应，从而触发致死性级联反应，显著加剧铁死亡应激并驱动 TNBC 细胞走向不可逆死亡（图4v）。

（5）体内肿瘤靶向性与生物安全性评估

近红外荧光成像采用 IVIS Spectrum系统在注射后0、2、6、12、24及36小时进行，以动态监测生物分布及肿瘤蓄积动力学（图5a）。三组间 NIRF 信号分布存在显著差异（图5b和5e）。为进一步评估全身生物分布及清除途径，注射后12小时处死小鼠。切除肿瘤及主要器官后进行离体 NIRF 成像及定量分析（图5c和5f）。CyPCs- JPH 在肿瘤组织中显示出最强荧光信号。在非肿瘤器官中，肾脏呈现最高信号强度，而肝脏摄取程度相对中等（图5f）。通过12小时获取的肿瘤切片 CLSM 成像及三维重建技术评估瘤内渗透及空间分布（图5d）。荧光区域覆盖率定量分析证实CyPCs- JPH 的肿瘤渗透程度显著优于任一对照组（图5g）。

（6）CPCs- JPH 在原位4T1肿瘤中的抗肿瘤疗效及铁死亡介导机制

在 BALB /c小鼠中建立了原位4T1-luc肿瘤模型，所有治疗组均每隔一天接受静脉注射，共给药三次（图6a）。疗后第28天的BLI分析显示，与所有对照组及比较组相比，CPCsJPH组的生物发光信号强度显著降低（图6b和6c），表明该方案对肿瘤代谢活性及增殖具有显著抑制作用。第29天处死小鼠后，切除原发肿瘤进行离体分析。CPCs- JPH 组的肿瘤体积和重量较其他治疗组均明显减小，肿瘤生长抑制率达81.2%，证实其在体内具有更优的抗肿瘤疗效（图6d和6e）。通过H&E染色检查显示，CPCs- JPH 组的肿瘤结构严重紊乱，表现为广泛的核固缩和胞质空泡化，这些形态学特征与铁死亡相符（图6h）。定量分析显示CPCs- JPH 组中Ki-67阳性细胞数量显著减少（图6h和6i），支持其抗增殖作用。经CPCs- JPH 处理的肿瘤中这两种蛋白均显著下调（图6h、6j和6k），表明细胞抗氧化系统功能受损并促进脂质过氧化。通过联合给药Fer-1进一步验证了铁死亡的功能依赖性：腹腔注射Fer-1显著削弱了CPCs- JPH 的抗肿瘤效果，肿瘤体积和重量均回升至接近对照组水平（图6f和6g）。

图6.CPCs-JPH的体内铁死亡诱导及抗肿瘤疗效。（a）原位4T1荷瘤小鼠的治疗方案；（b）第7、14、21和28天4T1荷瘤小鼠的代表性BLI图像；（c）各处理组4T1肿瘤BLI强度的定量分析；（d）第29天切除的4T1肿瘤明场图像；（e）各处理组肿瘤重量的定量分析；（f）对照组、CPCs-JPH组及CPCs-JPH+Fer1组第29天切除的4T1肿瘤明场图像；（g）三组肿瘤重量的定量分析；（h）各处理组Ki-67、SLC7A5和GPX4染色的肿瘤切片H&E和IHC代表性图像；（i-k）各处理组Ki-67、SLC7A5和GPX4的IHC定量分析。

（7）CPCs- JPH诱导免疫原性细胞死亡及抗肿瘤免疫激活作用

采用不同制剂处理4T1细胞并检测经典 ICD 标志物的表达（图7a）。 CLSM 成像显示CPCs- JPH 处理可显著诱导钙网蛋白（CRT）的表面暴露及高迁移率族蛋白1（HMGB1）的胞质转位（图7b）。定量荧光分析证实，CPCs- JPH 组中这两种标志物表达均显著升高（图7c和7d）。蛋白质印迹法进一步显示CRT与HMGB1的细胞总水平均增加（图7e-g）。酶联免疫吸附试验（ELISA）表明，细胞外HMGB1在CPCs- JPH 组中的分泌量最为丰富（图7h）。为功能验证该免疫原性潜力，将经CPCs- JPH 预处理的4T1细胞与骨髓来源树突状细胞（BMDCs）共培养后，诱导产生的CD80+CD86+成熟 BMDC 数量显著多于其他组别（图7i和7j）。这些发现的体内相关性通过原位移植4T1荷瘤小鼠模型进行验证（图7k）。在为期60天的观察期内，CPCs-JPH对肿瘤生长的抑制最为强效（图7l和7m）。接受CPCs- JPH 治疗的小鼠中有29%存活超过该时间点，这凸显了其持久的治疗效果（图7n）。对 TME 的免疫组分分析进一步显示，CPCs- JPH 治疗组肿瘤中成熟树突状细胞（DCs）浸润程度最高（图7o和7p）。CLSM 成像与流式细胞术定量分析均一致表明，与所有其他组别相比，CPCs- JPH 治疗组肿瘤内CD8⁺T细胞数量显著增加（图7q和7r）。

图7.体外和体内抗肿瘤免疫应答。（a）CPCs-JPH体外治疗、ICD标志物分析及DC成熟实验示意图；（b）各处理组4T1细胞HMGB1和CRT的代表性IF图像；（c、d）各处理组HMGB1和CRT的定量荧光分析；（e-g）各处理组CRT和HMGB1的蛋白质印迹及定量分析；（h）各处理组胞外HMGB1的ELISA定量；（i、j）与预处理的4T1细胞共培养后CD80⁺CD86⁺ BMDCs的流式细胞术及定量分析；（k）原位4T1荷瘤小鼠的治疗方案；（l）各处理组4T1荷瘤小鼠个体肿瘤生长曲线蜘蛛图；（m）各处理组4T1荷瘤小鼠平均肿瘤生长曲线；（n）4T1荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲线；（o、p）各处理组肿瘤组织中CD45⁺CD11c⁺CD80⁺CD86⁺ DCs的流式细胞术及定量分析；（q）不同处理后肿瘤切片中CD8⁺ T细胞的代表性CLSM图像；（r）各处理组4T1肿瘤中CD45⁺CD3⁺CD8⁺ T细胞的流式定量分析。