针对上述问题，温州医科大学附属第一医院杨晨团队提出基于离子掺杂策略，将具有成骨活性的金属离子（如Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺）引入普鲁士蓝纳米酶骨架中，构建了一类兼具抗氧化与成骨诱导功能的“成骨纳米酶”（XPB）。通过体外实验系统筛选并优化其ROS清除能力与成骨性能，进一步对其结构特性、生物学效应及作用机制进行深入分析；同时，在两种典型糖尿病骨缺损模型（牙周炎诱导的牙槽骨吸收模型和颅骨缺损模型）中验证其体内骨再生效果。该研究提出了一种集ROS清除、炎症调控与成骨诱导于一体的多功能治疗策略，为糖尿病骨修复提供了新的材料设计思路，并为病理条件下骨组织工程的发展奠定了基础。该文章于2026年3月22日以《Osteogenic Nanozymes for Diabetic Bone Regeneration via Synergistic Antioxidant and Osteoinductive Functions》为题发表于《Advanced Materials》（DOI: 10.1002/adma.72833）。

研究示意图. 用于糖尿病骨再生的“成骨纳米酶”概念。通过将成骨金属离子X（X = Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mo²⁺或Eu³⁺）掺入普鲁士蓝（PB）纳米酶中，设计并构建了促成骨纳米酶。随后，对所得的XPB制剂进行系统筛选，以确定具有增强的抗氧化和成骨活性的最佳候选物。所选的XPB纳米酶兼具强大的抗氧化和抗炎功能以及优异的成骨能力，因此，当以纳米颗粒形式直接给药时，可减轻牙周骨丢失；当作为功能性成分掺入糖尿病大鼠的骨支架中时，可促进颅骨缺损修复。

（1）成骨XPB纳米酶的合成与筛选

采用离子交换策略合成多种离子掺杂普鲁士蓝纳米酶（XPB）（图1A），包括Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mo²⁺和Eu³⁺。SEM和TEM结果显示，各纳米酶均呈均一立方结构，粒径分布集中，水合粒径约为234.6–284.7 nm（图1B）。EDS证实8种金属元素成功掺入且未破坏晶体结构（图1C），ICP结果表明掺杂量（X/Fe）约为6.5–8.4 wt.%。抗氧化性能评估显示，所有XPB纳米酶对ABTS·⁺和DPPH自由基的清除能力均显著高于未掺杂PB（图1D，E），其中CoPB和CuPB在ABTS·⁺清除中提升最显著（149.32%和142.89%），CuPB和MoPB在DPPH清除中表现最优（133.5%和116.71%）。细胞毒性实验表明PB在高于50 µg/mL时出现明显毒性，而在3.13 µg/mL时细胞存活率最高；在该浓度下，各XPB纳米酶均未表现出明显细胞毒性。成骨能力评价显示，XPB均可不同程度上调BMSCs中ALP表达（图1F，G），其中CuPB和ZnPB提升最显著（110.58%和127.04%）。综合抗氧化及成骨性能，CuPB表现最优。

图1.成骨诱导型XPB纳米酶的筛选。(A) XPB纳米酶的合成示意图。(B) 不同XPB纳米酶的SEM和TEM图像（右上角插图）。比例尺：100 nm。(C) 不同XPB纳米酶的EDS元素映射图。比例尺：100 nm。(D) 不同XPB纳米酶的ABTS·⁺清除率和(E) DPPH自由基清除率。n = 3。(F,G) 不同XPB纳米酶处理的BMSCs的代表性ALP染色图像和定量ALP活性。

（2）筛选出的 CuPB 纳米酶的表征

对CuPB纳米酶的结构与催化性能进行表征。XRD结果表明其保持典型普鲁士蓝晶体结构，Cu掺杂未引起结构改变（图2A）；XPS显示Cu主要以Cu²⁺形式存在，并伴随少量Cu⁺（图2B，C）。ROS清除实验表明，PB与CuPB均具有清除·OH、·O₂^-和H₂O₂的能力（图2D），其中CuPB清除效率分别提高40.16%、46.99%和56.69%；ESR结果进一步验证CuPB对·OH和·O₂^-的清除能力增强（图2E，F）。H₂O₂分解实验显示CuPB具有更快的产氧速率（图2G）；米氏动力学分析表明CuPB的Km值低于PB（175 mM vs 200 mM），表明其具有更高底物亲和力和更强的CAT样活性（图2H）。综合分析表明，两者均具备CAT、SOD和POD样活性，且Cu掺杂显著提升催化性能（图2I）。DFT计算结果显示，PB与CuPB在CAT样反应过程中均可自发吸附H₂O₂并发生分解（图2J）。自由能分析表明，CuPB在关键电子转移步骤中无需克服能垒，而PB需克服0.17 eV能垒；在产物脱附过程中，CuPB能垒（0.35 eV）低于PB（0.95 eV）（图2K）。结果表明，Cu掺杂降低了反应能垒并加速催化过程，从而提升CAT样催化活性。

图2.筛选得到的CuPB纳米酶的表征。(A) PB和CuPB纳米酶的XRD图谱；(B) PB和CuPB纳米酶的XPS扫描图谱；(C) CuPB中Cu 2p的详细XPS谱图；(D) 使用商业试剂盒评估PB和CuPB纳米酶对活性氧（·OH、·O₂-和H₂O₂ ）的清除率。n = 3；(E) 通过ESR测定PB和CuPB纳米酶对·OH和·O₂⁻的清除能力；(F) 通过ESR测定PB和CuPB纳米酶对·O₂^-的清除能力；(G)通过测量氧气生成量测定PB和CuPB纳米酶对H₂O₂的清除能力。n = 3； ( H) PB和CuPB纳米酶的米氏动力学。Km代表米氏常数； (I) PB和CuPB纳米酶多种酶活性的示意图。 （J）拟议的类CAT催化反应路径和（K）PB和CuPB纳米酶相应的吉布斯自由能曲线。图I由BioRender.com制作。

（3）CuPB纳米酶抑制RAW 264.7细胞中H₂O₂诱导的炎症反应

RAW 264.7细胞实验表明，PB和CuPB均可被细胞摄取，并在1–4 h内明显富集；与LysoTracker共定位结果显示二者主要定位于溶酶体（图3A，B）。在H₂O₂刺激下，PB和CuPB均可降低细胞内ROS水平（图3C），其中CuPB的清除效率较PB提高约35.63%（图3D）。炎症相关基因检测结果显示，H₂O₂显著上调Tnf、Nos2和Il1α表达，PB和CuPB处理均可下调上述指标（图3E–G），且CuPB降低幅度更大（分别为31.53%、31.99%和51.18%）。iNOS免疫荧光结果进一步验证CuPB具有更强的炎症抑制作用（图3H，I）。

图3.CuPB纳米酶抑制RAW 264.7细胞中H₂O₂诱导的炎症反应。(A,B) 代表性荧光图像显示溶酶体（绿色）与PB或CuPB纳米酶（红色）的共定位。比例尺：20 µm。(C,D) 通过DCFH-DA染色检测和定量细胞内ROS。比例尺：50 µm。n = 5。(E–G)通过RT-qPCR测定促炎标志物（Tnf、Nos2和Il1α ）的相对mRNA表达水平。n = 6。(H,I) iNOS的代表性免疫荧光图像及其相应的定量分析。比例尺：50 µm。n = 5。

（4）CuPB纳米酶促进BMSCs的成骨分化

BMSCs摄取实验表明，PB与CuPB均可被细胞有效内吞，并在4 h后主要定位于溶酶体，二者摄取效率无显著差异（图4A，B）。成骨分化评价结果显示，CuPB组钙结节形成最为显著（图4C），矿化水平较Blank组和PB组分别提高60.9%和61.2%（图4D）。qPCR结果表明，PB与CuPB均可上调成骨相关基因Bglap、Alpl、Spp1和Runx2表达，且CuPB提升更显著，较PB分别增加62.28%、84.15%、143.53%和231.72%（图4E–H）。WB结果显示CuPB进一步促进OPN和RUNX2蛋白表达，较PB分别提高32.2%和36.28%（图4I–K）；免疫荧光结果同样显示CuPB组RUNX2表达更高（图4L，M）。

图4.CuPB纳米酶促进BMSCs的成骨分化。(A,B) 代表性荧光图像显示溶酶体（绿色）与PB或CuPB纳米酶（红色）的共定位。比例尺：20 µm。(C,D) 通过ARS染色检测钙沉积及其相应的定量分析。比例尺：100 µm。n = 6。(E–G)通过RT-qPCR测定成骨基因（包括Bglap、Alpl、Spp1和Runx2 ）的相对mRNA表达水平。n = 6。(I–K) OPN和RUNX2的WB分析及其相应的定量分析。n = 3。(L,M) RUNX2的代表性免疫荧光图像及其相应的定量分析。比例尺：50 µm。n = 5。

（5）CuPB纳米酶成骨活性的机制研究

转录组测序结果显示，CuPB处理组与对照组在PCA分析中明显分离（图5A），共筛选出差异表达基因862个（上调516个，下调346个）（图5B），热图分析显示组内一致性良好且组间差异显著（图5C）。GO富集分析表明差异基因主要富集于细胞外基质重塑、成骨细胞分化正调控及破骨细胞分化负调控等过程（图5D）；GSEA结果进一步证实成骨相关通路显著上调（图5E）。KEGG分析显示PI3K-Akt和MAPK信号通路显著富集（图5F）。实验验证结果表明，CuPB可促进PI3K和Akt磷酸化，并上调RUNX2和ALP表达（图5G）；PI3K抑制剂LY294002处理后，上述效应被显著抑制。结果表明，CuPB通过激活PI3K-Akt信号通路促进成骨分化（图5H）。

图5.CuPB纳米酶处理BMSCs后的转录组分析及激活的信号通路。(A) 生物学重复样本的主成分分析。n = 3。(B) CuPB组和空白组间差异表达基因(DEGs)的统计分析。(C) 热图显示两组间DEGs的表达谱。(D) 与骨形成相关的生物学过程的GO富集分析。(E) GSEA图突出显示成骨相关基因集的富集情况。(F) DEGs中富集程度最高的10个KEGG通路，其中PI3K-Akt信号通路以红色突出显示。(G) 在CuPB和PI3K抑制剂LY294002存在下，PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达的Western blot分析及相应的定量分析。n = 3。 (H) CuPB纳米酶促进BMSCs成骨分化的机制示意图。

（6）CuPB纳米酶可减轻糖尿病大鼠牙周炎引起的骨质流失

在2型糖尿病合并牙周炎模型中，Micro-CT结果显示结扎后牙槽骨明显吸收（图6A，B）；PB和CuPB处理均可改善骨缺损，其中CuPB组牙槽骨高度接近Sham组。CEJ-ABC距离由PD组的0.80 ± 0.02 mm分别降低至PB组0.71 ± 0.06 mm和CuPB组0.42 ± 0.04 mm（图6C）。骨结构分析显示，PD组BV/TV和Tb.N降低、Tb.Sp升高，PB可部分改善，而CuPB可显著恢复骨结构参数接近正常水平（图6D–F）。组织学结果显示，PD组存在明显骨丧失、上皮破坏及炎症浸润，PB和CuPB均可缓解，其中CuPB效果更显著（图6G）；Masson染色显示CuPB促进胶原沉积与重建。免疫荧光结果显示，CuPB显著降低TNF-α表达（图6H），并显著提高RUNX2表达（较PD组提高391.42%，较PB组提高203.36%）（图6I）。主要脏器未见明显病理变化。体内分布结果显示，CuPB在牙龈部位信号随时间减弱，并主要在结肠、肝脏和肾脏中分布，其中结肠信号最强，提示主要经胃肠道排泄；至第4天体内荧光基本消失。结果表明CuPB具有良好的体内安全性及显著的骨再生效果。

图6.CuPB纳米酶可减轻2型糖尿病大鼠牙周炎引起的骨丢失。(A)体内研究的实验方案。(B)代表性的微型CT图像和牙槽骨三维重建。箭头指向牙釉质-牙槽骨连接处(CEJ-ABC)。三维重建图像中的虚线标出了感兴趣区域。(C–F)CEJ-ABC距离(C)、骨体积/组织体积比(BV/TV)(D)、小骨间距(Tb.Sp)(E)和小骨数量(Tb.N)(F)的统计分析。n = 6。(G)上颌第一和第二磨牙间牙周组织的H&E染色图像。黄色虚线代表牙槽骨。比例尺：500 µm。(H,I)牙周组织中TNF-α(H)和RUNX2(I)的免疫荧光染色图像。比例尺：100 µm。假手术组：未结扎的糖尿病大鼠；PD组：结扎诱导的牙周炎，用PBS治疗；PD+PB组：用PB纳米酶治疗；PD+CuPB组：用CuPB纳米酶治疗。

（7）CuPB/PCL复合支架的制备与表征

构建CuPB/PCL复合支架以提升纳米酶在骨修复中的应用性能。宏观观察显示，随CuPB含量增加支架颜色逐渐加深，提示颗粒分布均匀（图7A）；SEM结果显示支架纤维直径约500 µm、孔径约400 µm，各组结构一致（图7B）。截面EDS分析证实CuPB在支架中均匀分布（图7C），高倍SEM显示其立方结构保持完整（图7D）。力学测试表明，随着CuPB含量增加，压缩强度和杨氏模量显著提高，其中0.2 wt.% CuPB组分别提高125.61%和84.25%（图7E，F）。降解实验显示，CuPB掺入可加速支架降解，且呈浓度依赖性（图7G）。抗氧化性能测试表明，ABTS和DPPH自由基清除能力随CuPB含量增加而增强（图7H，I）；同时对H₂O₂、·O₂⁻和·OH均表现出显著清除能力（图7J）。结果表明，该复合支架具有良好的结构性能及抗氧化功能。

图7.CuPB/PCL复合支架的表征。(A) 不同CuPB纳米酶浓度下3D打印CuPB/PCL复合支架的数码照片。(B) 3D打印支架大孔结构的SEM图像。比例尺：500 µm。(C) CuPB/PCL复合支架横截面的EDS元素映射图。比例尺：100 µm。(D) CuPB/PCL复合支架横截面的SEM图像。比例尺：500 nm。红色箭头指示嵌入的纳米酶。(E) 不同支架的抗压强度和(F) 不同支架的杨氏模量。n = 5。(G) 不同支架的加速降解速率。n = 5。(H) 不同支架的ABTS·⁺清除率和(I) 不同支架的DPPH自由基清除率。n = 3。（J ）使用商业检测试剂盒测定PCL和0.1%CuPB/PCL复合支架对活性氧（H₂O₂、·O₂^-和·OH）的清除率。n = 3。

（8）CuPB纳米酶赋予CuPB/PCL复合支架增强的抗炎和促骨生成特性

体外实验结果显示，CuPB/PCL支架均可促进BMSCs增殖，其中0.1 wt.% CuPB/PCL组效果最显著（图8A）。ALP染色结果表明，PCL对ALP活性无明显影响，而CuPB/PCL显著提高ALP表达（图8B）；ARS染色显示CuPB/PCL显著促进钙结节形成。qPCR结果进一步证实，CuPB/PCL显著上调Bglap、Alpl、Spp1和Runx2表达，而PCL组无明显变化（图8C–F）。抗氧化与抗炎实验表明，PCL对H₂O₂诱导的ROS无明显抑制作用，而CuPB/PCL显著降低细胞内ROS水平（降低108.99%）（图8G，H）；同时显著下调Nos2、Tnf和Il1α表达（图8I–K）。结果表明CuPB/PCL支架具备成骨、抗氧化及抗炎功能。

图8.CuPB纳米酶赋予CuPB/PCL复合支架增强的抗炎和促骨生成特性。(A) BMSCs在不同支架上培养1、3和5天后的增殖情况。n = 6。(B) BMSCs与PCL或CuPB/PCL支架共培养7天后的ALP染色。比例尺：100 µm。(C–F) BMSCs在PCL或CuPB/PCL支架上培养14天后，成骨标志物（ Bglap、Alpl、Spp1和Runx2 ）的mRNA表达情况。n = 6。(G,H) RAW 264.7细胞经H₂O₂刺激后，与PCL或CuPB/PCL支架共培养后的DCFH-DA染色图像及相应的荧光强度定量分析。比例尺：50 µm。n = 5. (I–K)与PCL或CuPB/PCL支架共培养后，H₂O₂刺激的RAW 264.7细胞中促炎标志物（Nos2、Tnf和Il1α）的mRNA表达水平。n = 6 。

（9）CuPB/PCL复合支架促进糖尿病颅骨缺损的骨再生

在2型糖尿病大鼠颅骨临界缺损模型中，Micro-CT结果显示Blank组和PCL组新骨形成有限，而CuPB/PCL组在缺损边缘及内部形成大量新骨组织（图9A，B）。定量分析表明，CuPB/PCL组BV/TV较Blank组和PCL组分别提高223.28%和113.3%，同时Tb.Th和Tb.N显著增加（图9C，D）。组织学结果显示，Blank组和PCL组新骨主要局限于缺损边缘，而CuPB/PCL组新骨向缺损中心延伸（图9E）；Masson染色显示CuPB/PCL组成熟骨组织比例更高。免疫荧光结果表明，CuPB/PCL组TNF-α表达降低（图9F），RUNX2表达显著升高（图9G）。主要脏器未见明显病理变化。结果表明CuPB/PCL支架可显著促进糖尿病骨缺损修复。

图9. CuPB/PCL复合支架促进糖尿病颅骨缺损部位的骨再生。(A) 体内研究的实验方案。(B) 缺损区域内新形成骨组织的微型CT图像和三维重建。黄色区域表示新形成的骨组织。比例尺：1 mm。(C,D) 缺损区域骨体积/组织体积比(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)的定量分析。n = 6。(E) 新形成骨组织的H&E染色图像。虚线框分别表示缺损的中心区域和周边区域。比例尺：200 µm。(F,G) 新再生骨组织中TNF-α (F) 和RUNX2 (G) 的免疫荧光染色图像。比例尺：100 µm。空白组：未经治疗的糖尿病颅骨缺损；PCL组：用PCL支架治疗的糖尿病颅骨缺损。 CuPB/PCL：采用 CuPB/PCL 支架治疗糖尿病颅骨缺损。