针对上述问题，哈尔滨工业大学杨奎琨教授团队设计了一种仿生肿瘤细胞衍生微粒，用于肿瘤靶向共递送舒拉辛（Syr）和多柔比星前药（Dox- EMCH）。Syr可抑制乳酸外排，从而破坏肿瘤细胞内外的pH稳态。细胞内酸度的升高激活Dox- EMCH 以诱导免疫原性细胞死亡，而肿瘤细胞外酸度的降低通过恢复细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性、促进M1样巨噬细胞极化以及抑制调节性T细胞，从而调节免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。因此，这些仿生微粒通过破坏肿瘤组织中的细胞内和细胞外pH平衡，启动协调化的化疗和免疫治疗，实现有效的肿瘤抑制。该文章于2026年2月23日以《A Biomimetic Microparticle Disrupting the Intracellular/Extracellular pH Homeostasis of Tumor Cells for Cancer Chemo-Immunotherapy》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10 1021 acsnano 5c22145）。

（1）Syr/Dox- EMCH @MPs的制备、表征及肿瘤靶向能力研究

Syr/Dox-EMCH@MPs呈现出与MPs相似的杯状形态（图1B）。Syr/Dox-EMCH@MPs的肿瘤靶向积累主要通过肿瘤细胞对微颗粒的同型识别介导。因此，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估了不同细胞对Syr/Dox-EMCH@MPs的摄取情况（图1C）。根据流式细胞术分析，Syr/Dox-EMCH@MPs在4T1细胞中的荧光强度比CT26细胞高3.75倍，比RAW细胞高4.94倍，表明与同型4T1细胞相比，异型CT26和RAW细胞对微颗粒的摄取较低（图1D）。为了评估Syr/Dox-EMCH@MPs在肿瘤中的靶向积累，通过静脉注射将微颗粒注入荷4T1和CT26肿瘤的小鼠体内，并通过活体成像系统进行监测（图1E）。荧光信号在4T1肿瘤组织中逐渐增强，并在注射后48小时达到平台期，且信号强度比CT26肿瘤高3.83倍，表明Syr/Dox-EMCH@MPs在同型4T1肿瘤中具有特异性识别和增强积累的特性（图1F）。

图1. Syr/Dox- EMCH @MPs的特性分析与同型肿瘤靶向性。(A) 通过协同化疗免疫疗法制备Syr/Dox- EMCH @MPs及其抗肿瘤效果示意图。(B) Syr/DoxEMCH@MPs透射电子显微镜(TEM)图像。(C) DiD标记Syr/Dox- EMCH @MPs孵育后4T1、CT26及RAW细胞共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。(D) 通过流式细胞术对4T1、CT26及RAW细胞摄取Syr/Dox- EMCH @MPs的定量分析。(E) 同时携带4T1与CT26肿瘤的小鼠体内荧光监测实验，静脉注射DiR标记Syr/Dox- EMCH @MPs。(F) 4T1或CT26肿瘤中Syr/Dox- EMCH @MPs平均荧光强度(MFI)。

（2）Syr介导的肿瘤细胞内/外pH稳态破坏

肿瘤细胞主要依赖MCT1和MCT4外排乳酸，这一过程对于维持其细胞内pH稳态至关重要。Syr/Dox-EMCH@MPs将Syr递送至肿瘤细胞，有望有效阻断乳酸外排，从而增强细胞内酸化并缓解细胞外酸中毒。为了评估Syr介导的乳酸外排阻断及相关pH变化，分别用PBS、MPs、Syr@MPs、Dox-EMCH@MPs和Syr/Dox-EMCH@MPs处理4T1细胞（Dox当量为10 μM，Syr当量为10.7 μM）。Syr@MPs和Syr/Dox-EMCH@MPs均显著提高了细胞内乳酸水平并降低了细胞外乳酸浓度（图2A、B）。 consequently，由于Syr介导的乳酸外排抑制，Syr/Dox-EMCH@MPs将细胞内pH从7.32 ± 0.04显著降低至6.59 ± 0.16（图2C），而细胞外pH在用负载Syr的微颗粒孵育后从6.80 ± 0.04升高至7.00 ± 0.02（图2D）。因此，Syr/Dox-EMCH@MPs对4T1细胞表现出比其他制剂更显著的细胞毒性，这可能是由于更酸性的细胞内微环境促进了Dox的活化（图2E）。根据活/死细胞双染和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）双染实验，Syr/Dox-EMCH@MPs也比其他组导致了更高的4T1细胞凋亡和坏死（图2F和G）。

图2. Syr/Dox- EMCH @MPs通过破坏细胞内/细胞外pH稳态增强对4T1细胞的细胞毒性作用。(A和B) 不同处理后4T1细胞的细胞内及细胞外乳酸水平与(C和D)pH值。(E) 不同制剂暴露下4T1细胞的存活率及(F)活/死细胞分析。(G) 流式细胞术检测不同处理24小时后4T1细胞的凋亡与坏死情况（n=3）。

（3）Syr/Dox- EMCH @MP介导的肿瘤细胞 ICD

Syr/Dox-EMCH@MP通过协同细胞内酸化与Dox活化诱导最强免疫原性细胞死亡（ICD）并促进树突状细胞成熟。化疗药物如阿霉素（Dox）、喜树碱和奥沙利铂均可通过ICD激发抗肿瘤免疫，本研究以Dox当量10 μM、Syr当量10.7 μM评估该微颗粒的ICD效应（图3A-D）：与PBS或MPs组相比，Syr@MP和Dox-EMCH@MP组钙网蛋白（CRT）暴露适度增加、ATP释放增强、核高迁移率族蛋白B1（HMGB1）轻度减少，而Syr/Dox-EMCH@MP组DAMPs释放最显著，证实协同策略诱导最强ICD。Transwell共培养实验进一步显示（图3E），Syr/Dox-EMCH@MP处理的4T1细胞促进树突状细胞（DC）成熟效果最显著（图3F-G），且该组促炎细胞因子水平最高（图3H-I），验证其增强的免疫应答。

图3. Syr/Dox- EMCH @MP介导的体外 ICD 及抗肿瘤免疫反应。(A) CLSM 图像显示CRT暴露情况及4T1细胞经相应处理后HMGB1的释放情况。 (B) CRT暴露量的定量分析，(C) 4T1细胞上清液中HMGB1水平，(D) 不同处理后4T1细胞内ATP水平变化。(E) Transwell实验示意图。(F) 不同处理后成熟骨髓来源树突状细胞（BMDCs，CD80+ CD86+）的流式细胞术检测结果及(G) 定量分析。(H和I) 通过 ELISA 测定BMDCs分泌IL-6和 TNF - α 的能力。

（4）Syr/Dox-EMCH@MPs重编程细胞内/细胞外pH平衡

为了评估Syr/Dox-EMCH@MPs在肿瘤中重编程细胞内/细胞外pH稳态的潜力，在荷4T1肿瘤小鼠中定量检测了肿瘤内乳酸和pH的变化（图4A）。Syr@MPs和Syr/Dox-EMCH@MPs均导致肿瘤细胞内乳酸浓度增加以及肿瘤间质中细胞外乳酸水平降低，这可能是由于有效阻断了肿瘤细胞的乳酸外排（图4B和C）。将细胞外pH敏感荧光探针（Carboxy-SNARF 1）瘤内注射以揭示肿瘤中细胞外pH的变化（图4D）。在最后一次给予Syr/Dox-EMCH@MPs后5天，细胞外pH从6.71 ± 0.10升高至7.19 ± 0.05，从而为抗肿瘤免疫监视建立了有利的TME（图4E）。为了进一步研究体内细胞内pH的变化，将肿瘤组织制备成单细胞悬液，并用细胞内pH荧光探针（Protonex Red 670 acid）染色。在Syr/Dox-EMCH@MPs注射后5天，细胞内pH从7.12 ± 0.05降低至6.57 ± 0.08，证实了乳酸外排抑制后细胞内酸化的增强（图4F）。

图4. Syr/Dox- EMCH @MPs在体内对细胞内/细胞外pH稳态的重编程作用。(A) 细胞内/细胞外pH检测方案示意图。细胞外pH通过pH响应性荧光探针Carboxy-snarf 1进行监测，而细胞内pH则使用荧光探针Protonex Red 670 acid进行测量。(B) 不同处理后细胞内乳酸含量及(C) 肿瘤间质中乳酸水平变化。(D) 不同制剂处理后肿瘤细胞外pH的多光谱荧光图像及(E) 对应的细胞外pH值。(F) 不同处理后4T1肿瘤细胞内pH值变化。

（5）Syr/Dox-EMCH@MPs的体内免疫激活

得益于细胞内酸化增强的肿瘤细胞ICD和细胞外中和介导的免疫抑制性TME减弱，Syr/Dox-EMCH@MPs有望在不使用任何免疫检查点抑制剂的情况下启动强效的抗肿瘤免疫应答（5A-N）。与对照组相比，该处理组小鼠HMGB1水平显著升高，淋巴结中成熟DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例更高，脾脏中辅助性T细胞（CD3⁺CD4⁺）和CTLs（CD3⁺CD8⁺）数量显著增加（图5A-D）。肿瘤微环境中M1样巨噬细胞、NK细胞及IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞比例均高于其他治疗组，而Tregs（CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺）浸润降至6.80±0.78%，远低于PBS组（17.45±2.11%）（图5E-J）。血清中促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6）显著升高，抗炎因子IL-10降低（图5K-N）。这些结果表明，Syr/Dox-EMCH@MPs通过协调乳酸外排阻断和Dox活化，有效促进CTLs与NK细胞浸润、诱导TAMs向M1极化并抑制Tregs增殖，从而形成有利的免疫TME并激发强烈的抗肿瘤免疫应答。

图5.Syr/Dox- EMCH @MPs诱导的抗肿瘤免疫应答。（A和B）淋巴结中成熟树突状细胞（CD11c+ CD86+ CD80+）的流式细胞术分析。(C)不同处理组小鼠脾脏中CD3+ CD4+ T细胞的流式细胞术分析；(D)CD3+ CD8+ T细胞的流式细胞术分析。（E-J）治疗后小鼠肿瘤组织中：(E)M1/M2型巨噬细胞、(F) NK 细胞、（G-H）IFN - γ 生成性CD8+ T细胞及（I-J）调节性T细胞（Tregs）的流式细胞术定量分析。（K-N）不同处理组小鼠血清中 TNF - α 、 IFN - γ 、IL-6及IL-10的定量检测。

（6）Syr/Dox-EMCH@MPs的体内抗肿瘤性能

受Syr/Dox-EMCH@MPs的肿瘤靶向积累、细胞内/细胞外pH稳态破坏以及免疫激活能力的鼓舞，进一步在双侧荷4T1肿瘤小鼠中评估了其抗癌性能。将荷瘤小鼠随机分为5组，分别静脉注射PBS、MPs、Syr@MPs、Dox-EMCH@MPs和Syr/Dox-EMCH@MPs（Dox当量为5 mg/kg，Syr当量为4.8 mg/kg）。在最后一次给药后立即将等量4T1细胞皮下接种于小鼠对侧腿部作为远端肿瘤，随后每2天监测远端肿瘤和原发肿瘤的体积，持续14天（图6A）。接受Syr@MPs或Dox-EMCH@MPs的小鼠表现出适度的肿瘤生长延迟，表明单独的乳酸外排阻断或Dox前药活化诱导了温和的抗肿瘤活性。相比之下，接受Syr/Dox-EMCH@MPs治疗的小鼠显著抑制了远端肿瘤和原发肿瘤的生长，表明Syr/Dox-EMCH@MP介导的乳酸外排抑制和Dox活化协同促进了抗肿瘤化学-免疫治疗（图6B-E）。Syr/Dox-EMCH@MPs显著的肿瘤抑制作用还得到了显著延长的生存期以及明显增强的肿瘤细胞凋亡和坏死的证实，这通过肿瘤组织切片的H&E和TUNEL染色得以证明（图6F、G）。

图6. Syr/Dox- EMCH @MPs的体内抗肿瘤效果。(A)皮下接种4T1荷瘤 BALB /c小鼠的治疗方案示意图。(B)不同治疗方案后原发肿瘤及(C)远处转移瘤的生长曲线。(D)原发肿瘤与(E)远处转移瘤的肿瘤控制率。(F)不同治疗方案后肿瘤 TUNEL 染色结果。(G)不同治疗方案后小鼠生存曲线。

（6）Syr/Dox-EMCH@MPs的体内抗转移性能

得益于细胞内酸化增强的肿瘤细胞ICD和细胞外中和介导的免疫抑制性TME减弱，Syr/Dox-EMCH@MPs有望在不使用任何免疫检查点抑制剂的情况下启动强效的抗肿瘤免疫应答（5A-N）。与对照组相比，该处理组小鼠HMGB1水平显著升高，淋巴结中成熟DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例更高，脾脏中辅助性T细胞（CD3⁺CD4⁺）和CTLs（CD3⁺CD8⁺）数量显著增加（图5A-D）。肿瘤微环境中M1样巨噬细胞、NK细胞及IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞比例均高于其他治疗组，而Tregs（CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺）浸润降至6.80±0.78%，远低于PBS组（17.45±2.11%）（图5E-J）。血清中促炎因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6）显著升高，抗炎因子IL-10降低（图5K-N）。这些结果表明，Syr/Dox-EMCH@MPs通过协调乳酸外排阻断和Dox活化，有效促进CTLs与NK细胞浸润、诱导TAMs向M1极化并抑制Tregs增殖，从而形成有利的免疫TME并激发强烈的抗肿瘤免疫应答。

图7. Syr/Dox- EMCH @MPs的体内抗转移效果。(A)用于预防4T1荷瘤小鼠肿瘤转移的治疗方案示意图。(B)不同治疗组小鼠肺部肿瘤结节示意图及苏木精-伊红（H&E）染色肺切片照片。(C)各组小鼠肺转移结节数量对比。(D和E)不同治疗组小鼠脾脏中肿瘤相关巨噬细胞的流式细胞术定量分析结果。