针对上述问题，韩国顺天乡大学Byong-Taek Lee团队联合该校组织再生研究所构建了一种负载骨髓间充质干细胞（BMSCs）的藻酸盐-壳聚糖-TOCNF-dSECM可注射水凝胶（A₁C₀.₁T₁E₁₀+MSCs）。该体系通过Ca²⁺离子交联形成温敏凝胶网络，结合壳聚糖的广谱抗菌性、TOCNF的机械增强效应及dSECM的生物活性，实现自愈合、可降解与抗菌多功能一体化。MSCs的封装不仅避免其暴露于缺血或高ROS环境，还通过旁分泌作用持续释放生长因子，协同水凝胶激活Wnt/β-catenin信号通路，促进细胞增殖、血管新生、炎症调节及皮肤附属器再生。该文章于2026年3月6日以《MSCs-loaded injectable multifunctional dSECM hydrogels enhance wound healing through the activation of Wnt signaling pathways》为题发表于《Advanced Composites and Hybrid Materials》（DOI： 10.1007/s42114-026-01720-y）。

方案1.水凝胶的制备及其在伤口愈合中的应用示意图

（1）水凝胶的制备与理化表征

注射性测试（图1a）表明，所有水凝胶均具有良好的注射性，dSECM的加入未影响A1C0.1T1水凝胶的注射性。傅里叶变换红外光谱（图1b）显示，dSECM加入后酰胺峰强度增加，且未检测到额外杂峰。Zeta电位分析（图1c）表明，25℃时A1C0.1T1E0电位为−43.73±2.83 mV，加入dSECM后降至−69.8±0.98 mV；37℃时两者分别为−55.93±10.76 mV和−57.97±3 mV，提示dSECM在37℃下发生凝胶化。流变学分析（图1d-e）显示，所有样品的储能模量G'均大于损耗模量G''，且A1C0.1T1E0模量显著高于A1C0.1T1E10；频率扫描表明G'始终占主导，呈现类凝胶行为。粘度测试（图1f）显示，A1C0.1T1E0粘度高于A1C0.1T1E10，两者均呈剪切变稀特性。降解率（图1h）显示，2周内A1C0.1T1E10降解率为71.7±14.1%，A1C0.1T1E0为51.1±23.4%，dSECM促进了水凝胶降解。生长因子验证（图1i）表明，A1C0.1T1E10中生长因子浓度更高，符合预期。水和血液吸收性能（图1j-k）显示，两种水凝胶均具有良好的水吸收能力，A1C0.1T1E0因藻酸盐含量更高，血液吸收量高于A1C0.1T1E10。

图1.水凝胶的性能表征。（a）可注射性测试；（b）FTIR光谱；（c）25和37 ℃下的Zeta电位；（d）应变扫描下的储能模量和损耗模量；（e）角频率扫描；（f）剪切速率-粘度曲线；（g）剪切应力-剪切速率曲线；（h）体外降解；（i）水凝胶中生长因子的存在评估；（j）吸水率；（k）对水和枸橼酸全血的吸血能力。

（2）体外生物相容性及抗菌活性评价

细胞增殖实验（图2a）显示，与对照组相比，A1C0.1T1E0和A1C0.1T1E10水凝胶均促进小鼠成纤维细胞（L929）获得更高的细胞活力，且dSECM的加入进一步提高了细胞活力。间充质干细胞（MSCs）与含水凝胶的培养基共培养（图2b-c）期间未观察到不良现象，整个测试期内细胞存活率均超过对照组120%。细胞增殖结果（图2d）表明，在A1C0.1T1E0和A1C0.1T1E10水凝胶中，第1至第7天细胞均成功增殖。抗菌活性评估（图2e-f）显示，壳聚糖的加入增强了对金黄色葡萄球菌（抑制率126.61%±20.59）和大肠杆菌（抑制率116.92%±28.64）的抑制效果，对金黄色葡萄球菌的抑制更强；dSECM的整合进一步抑制了两种菌株的生长。

图2.水凝胶的体外细胞相容性及抗菌性能。（a）L929成纤维细胞培养1天和3天后的增殖共聚焦图像；（b）MSCs的共聚焦图像；（c）培养1、3、7天后的细胞活力；（d）各水凝胶对体外细胞增殖的影响；（e）抑菌圈定性结果；（f）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈定量分析。

（3）体外血液相容性及体内止血能力评价

溶血活性分析（图3a-b）显示，A1C0.1T1E0和A1C0.1T1E10水凝胶的溶血率均低于2.5%，远低于5%的安全阈值，表现出高血液相容性。血凝块能力评估（图3c-d）表明，两种水凝胶在不同时间点具有相当的血液凝固指数（BCI）值，dSECM的加入未明显影响A1C0.1T1水凝胶的凝血行为。在大鼠肝损伤模型中（图3e-g），止血时间分别为：商用纱布210±30秒、A1C0.1T1E0 38.3±4.3秒、A1C0.1T1E10 59±3秒；失血量分别为：商用纱布3.3±0.30 g、A1C0.1T1E0 0.50±0.2 g、A1C0.1T1E10 1.03±0.27 g。A1C0.1T1E0表现出最短的止血时间和最少的失血量。

图3.复合材料的体外及体内止血性能。（a）溶血活性的数码照片；（b）溶血率比较；（c）样品表面血凝块形成的数码照片；（d）体外动态全血凝血指数；（e）大鼠肝出血模型应用时的照片；（f）出血时间；（g）失血量。

（4）体内皮肤伤口愈合评价

大鼠全层皮肤缺损模型用于评估水凝胶的伤口愈合能力。术后第一周，A1C0.1T1E10水凝胶及A1C0.1T1E10水凝胶+MSCs处理组的伤口明显小于对照组（图4a-d）。术后2周，对照组残余伤口面积占比稍高，伤口收缩率为85%；A1C0.1T1E10水凝胶组和A1C0.1T1E10水凝胶+MSCs组伤口收缩显著，收缩率分别为97.88%和99.06%，其中A1C0.1T1E10水凝胶+MSCs组伤口闭合效果显著改善，该水凝胶具有加速伤口闭合的潜力（伤口愈合关键因素）。图4c显示皮肤下侧支血管的发育，进一步佐证其对伤口愈合过程的积极作用。海藻酸盐和壳聚糖组成的水凝胶可增强各修复阶段的伤口愈合，解决愈合障碍；含壳聚糖水凝胶因生物活性，在慢性伤口感染管理中具有潜力。壳聚糖基水凝胶凭借抗炎和抗菌特性，可建立适宜组织再生的微环境，调节伤口部位炎症反应并控制潜在感染，应对过度炎症可能导致的坏死及感染对愈合的阻碍。

图4.伤口愈合过程的体内评价。（a）大鼠皮肤切除伤口模型在处理期间的照片；（b）对照组与样品处理后皮肤伤口模型的伤口闭合率统计；（c）第 1 周与第 2 周伤口愈合及血管生成情况照片；（d）不同组间伤口愈合过程的对比分析；（e）伤口、水凝胶施加及伤口闭合过程的示意图。

组织学分析结果（图5）显示：治疗1周后，A1C0.1T1E10+MSCs水凝胶组真皮组织再生明显，并出现毛囊等皮肤附属器（图5a-b）；对照组新生表皮覆盖创面但真皮未完全再生，A1C0.1T1E10水凝胶组缺损区也完全被新生表皮覆盖。Masson三色染色（图5b）表明，所有组均有胶原沉积，其中A1C0.1T1E10+MSCs组胶原沉积更致密、有序（图5c）。各组均观察到新生表皮再生，A1C0.1T1E10+MSCs组的表皮层最厚（图5d）。以上结果表明，包载的MSCs促进了毛囊形成和胶原生成。

图5.不同伤口敷料处理后的皮肤组织学分析。（a）1周和2周的H&E染色；（b）1周和2周的Masson三色染色；（c）胶原沉积定量；（d）植入后1周和2周的新生表皮厚度定量。

免疫分析（图6a-b）显示，所有实验组在2周内均持续表达CD68，其中A1C0.1T1E10+MSCs水凝胶组的CD68表达最低（图6a）；该组的CD206表达显著增强。血管标记CD34染色（图6e-f）表明，A1C0.1T1E10+MSCs水凝胶组的CD34阳性染色强度高于对照组和A1C0.1T1E10水凝胶组。

图6.植入后宿主免疫反应及血管形成。（a）CD68；（b）CD206在植入后1和2周的表达；（c）CD68定量；（d）CD206定量；（e）CD34表达的定性及（f）定量分析。

（5）RNA测序揭示Wnt信号通路激活机制

RNA-seq分析（图7）显示：三组共有16,431个基因，各组分别有335、332和268个独特基因（图7a），转录组谱存在差异（图7b）。A1C0.1T1E10+MSCs组与对照组相比，1,320个基因上调、1,618个下调（图7c）。GO富集分析表明该组基因主要涉及解剖结构发育、细胞分化、细胞迁移调节、血管发育和细胞外基质相关过程（图7d）。聚类热图（图7e-h）和GSEA（图7i-k）显示，该组ECM组分、细胞迁移、血管生成和伤口愈合相关基因均上调。血管生成标记物在2周时表达高于1周（图7l），与免疫组化结果一致。炎症标记物分析（图7m）显示，1周时对照组M1标记物（CD14、IL23R等）表达更高，而A1C0.1T1E10+MSCs组M2标记物（CD209f、IL10Ra等）表达更高。细胞迁移标记物在1周时该组表达更高（图7n）。基质重塑标记物（图7o）多数在1周及2周时该组高表达。弦图（图7p）显示，该组多数细胞类型特异性标记物高表达，其中角质形成细胞标记物表达约为基线两倍，提示表皮层显著发育。

图7.皮肤样本的RNA-Seq分析。（a）差异表达基因维恩图；（b）基因表达热图；（c）上调和下调基因散点图；（d）GO富集分析；（e）ECM组分、（f）细胞迁移、（g）血管生成、（h）伤口愈合相关基因聚类热图；（i）细胞迁移、（j）血管生成、（k）伤口愈合的GSEA分析；（l）血管生成、（m）M1/M2炎症标志物、（n）细胞迁移标志物、（o）基质重塑标志物的表达热图；（p）各细胞类型标志物基因表达水平的弦图。

在KEGG通路富集分析（图8a）显示，Wnt、VEGF和Notch等信号通路参与伤口愈合，其中多个信号相关标记物在MSCs负载组中较对照组高表达。Wnt信号通路相关基因在MSCs负载组中表达显著升高（图8b及GSEA）。实时PCR进一步证实，MSCs负载组中Wnt1、β-catenin、LEF1、SP5、c-myc和CCND1的mRNA相对表达量均高于对照组（图8c-h）。图8i所示的机制模型表明，MSCs负载组中伤口愈合相关基因（如Collagen-I、Fibronectin、Keratin-14、VEGF、EGFR、Lgr5等）的表达强于对照组。

图8.转录组通路及机制分析。（a）KEGG通路富集分析；（b）Wnt信号通路的热图及GSEA分析；（c-h）A1C0.1T1E10+MSCs的相对RNA表达；（i）A1C0.1T1E10+MSCs促进伤口愈合的可能机制，涉及ECM形成、细胞增殖与迁移、再上皮化、毛囊形成及血管生成。