针对上述问题，华东理工大学刘昌胜、陈曦团队开发了一种多功能细胞外基质水凝胶（SDF@HA/BM），通过双重机制增强TBI治疗，在急性期对抗免疫抑制，在慢性期促进神经再生。该水凝胶由两种透明质酸（HA）衍生物通过动态席夫碱键交联形成，并负载基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）和脱细胞脑细胞外基质（BM）。其中，SDF-1α用于招募内源性NSPCs，HA用于维持免疫功能，BM用于诱导神经元分化和保护。将该水凝胶植入重度TBI小鼠模型后，发现其能增加急性期炎症因子产生、对抗免疫抑制，促进后期神经元再生和脑组织重塑，同时增强髓鞘形成、减轻反应性胶质增生，最终改善TBI小鼠的空间学习记忆能力并缓解抑郁行为。该研究为TBI治疗提供了免疫调节与神经再生相结合的新策略。该文章于2025年2月8日以《Counteracting immunodepression by extracellular matrix hydrogel to promote brain tissue remodeling and neurological function recovery after traumatic brain injury》为题发表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2025.123181）。

研究示意图

（1）HA-ADH、HA-ALD和BM的制备与表征

该研究以透明质酸（HA）为基材，通过EDC/NHS偶联和高碘酸钠氧化分别合成HA-ADH和HA-ALD衍生物，二者经席夫碱反应交联，并与脱细胞脑基质（BM）及SDF-1α构建动态水凝胶（图1A）。FTIR显示HA-ADH出现酰胺II带（~1555 cm⁻¹）和CH₂弯曲振动峰（~1374 cm⁻¹），HA-ALD出现醛基C=O峰（~1730 cm⁻¹），SDF-1α负载后该峰减弱表明其通过亚胺键（-C=N-）化学锚定（图1B）；¹H NMR证实HA-ADH在1.7 ppm和2.3 ppm处出现特征峰（图1C）。脱细胞处理使DNA含量降低97.5%（图1E），H&E和DAPI染色显示细胞核完全清除（图1D），同时BM保留94.2%的BDNF和90.5%的NGF（图1E）。

图1. SDF@HA/BM水凝胶的制备与表征。(A) 水凝胶制备的化学反应示意图。(B)HA、HA-ADH、HA-ALD、SDF100@HA/ALD和SDF1000@HA-ALD的FTIR光谱。(C)HA和HA-ADH的核磁共振氢谱。(D)天然和脱细胞脑组织的H&E染色图像(比例尺=100μm)。(E)DNA、BDNF和NGF在自然脑和去细胞脑中的定量(n=3)。(F)两种水凝胶的制备示意图和外观。(G)水凝胶的自愈和可注射特性的直观表示(标尺=1厘米)。(H1)用扫描电子显微镜观察HA/HA水凝胶和HA/BM水凝胶的内部微观形貌；(H2)测定两种水凝胶的孔径(比例尺=500μm，n=3)。(1)两种水凝胶在压缩下的应力-应变曲线；(2)压缩模数的计算(n=3)。(J)HA/HA水凝胶和HA/BM水凝胶的流变行为：(Ji)振荡频率扫描曲线，(J2)时间扫描曲线，(J3)幅度扫描曲线，(J4)循环应变扫描曲线。(K)正常培养液和HA/BM水凝胶(比例尺=200μm)培养的小鼠海马神经细胞(HT22)的细胞骨架染色。(L)HA/HA水凝胶和HA/BM水凝胶与神经元的细胞相容性(n=3)。

（2）SDF@HA/BM水凝胶的制备与表征

HA-ADH与HA-ALD的PBS溶液混合形成含动态席夫碱键的HA/HA水凝胶，引入BM后得到HA/BM水凝胶，最优配比为1% HA-ADH、3% HA-ALD和1% BM，凝胶时间2-5分钟（图1F），兼具可注射性和自修复性（图1G）。SEM显示冻干后HA/HA和HA/BM水凝胶孔径分别为294.1±13.7 μm和306.5±8.5 μm，呈互联互通多孔结构（图1H）；压缩模量分别为25.0±5.1 kPa和31.0±6.5 kPa，接近小鼠脑组织（49.1±23.8 kPa），可承受20%以上压缩应变（图1I）。流变学结果表明储存模量G'显著大于损耗模量G"，100 rad/s时G'分别为593 Pa和676 Pa，接近天然脑组织（~500 Pa）（图1J1、J2）；应变达到86%（HA/HA）和74%（HA/BM）时网络坍塌，1%-300%循环应变扫描显示结构可自修复并恢复接近初始强度（图1J3、J4）。细胞骨架染色显示水凝胶及其浸提液培养的神经元和小胶质细胞在数量、铺展、黏附及形态方面与正常培养基组无显著差异（图1K）。CCK-8检测显示HA/HA浸提液培养神经元第1天和第3天存活率分别为81.2%和90.2%，HA/BM组为81.7%和85.7%，均高于70%（图1L），符合ISO 10993-5:2009非显著细胞毒性标准；神经干细胞与HA/BM浸提液共培养存活率无显著变化。综上，HA/BM水凝胶对神经元活性有轻微负面影响，但不显著抑制小胶质细胞和神经干细胞增殖。

（3）SDF@HA/BM水凝胶可改善脑外伤小鼠的神经功能

  SDF@HA/BM水凝胶植入重度TBI小鼠损伤部位后，改良神经功能缺损评分（mNSS）显示TBI后第3天评分升高至7±1，第7天起SDF@HA/BM组与TBI组出现差异，第21天降至1±1，接近假手术组（0），而TBI组维持3±1（图2B）。平衡木测试显示第21天身体平衡能力改善（图2C）；悬尾试验中第14天和第21天挣扎时间延长，第21天达278秒，高于HA/BM组（262秒）和TBI组（211秒）（图2D）。Morris水迷宫定位航行训练4天后，SDF@HA/BM组找到平台时间（26.2秒）显著短于TBI组（43.5秒），接近假手术组（18.9秒）（图2E、F）；空间探索试验中SDF@HA/BM组最快找到目标区（15.1秒），目标区穿越次数增加、潜伏期缩短，提示记忆能力改善（图2G-J）。旷场试验显示SDF@HA/BM组自主运动距离（1819 cm）和中央区进入次数（19次）均大于TBI组（1342 cm；12次）（图2K-M）。综上，SDF@HA/BM水凝胶有利于改善TBI小鼠神经功能，推测源于急性期保护作用及后期对神经再生和组织重塑的持续修复效应（图2A）。

图2. SDF@HA/BM水凝胶改善了颅脑损伤后的功能结果。(A) 实验时间表示意图。(B)小鼠mNSS评分(n=10)。(C)小鼠平衡木评分(n=10)。(D)尾部悬吊实验小鼠挣扎时间(n=10)。(E)小鼠在Morris水迷宫训练阶段的逃避潜伏期和(F)典型游泳路径(n=10)。(G)Morris水迷宫实验(n=10)空间探索阶段小鼠的典型游泳路径、(H)游泳速度、(I)目标区域穿越和(J)到目标的潜伏期。(K)老鼠的典型运动轨迹和量化(L)移动的总距离和(M)开阔场地测试中中心区条目的数量(n=10)。

（4）SDF@HA/BM水凝胶促进脑外伤后神经元再生和脑组织重塑

术后35天NeuN和MAP2免疫荧光显示TBI导致神经元丢失和皮层严重缺损，水凝胶组阻止该损伤，SDF@HA/BM组神经元数量和形态接近正常（图3A、I、J）；术后42天GAP43和PSD95免疫荧光显示相同趋势（图3B、K），CD31和AQP4染色显示SDF@HA/BM组产生更多结构正常的微血管。透射电镜显示TBI组神经元结构破碎皱缩，水凝胶组结构完整（图3C）；TBI组髓鞘化轴突直径795 nm，HA/BM组数量显著增多但直径较小（594 nm），SDF@HA/BM组直径更大（1113 nm）且髓鞘厚度（204 nm）显著高于TBI组（150 nm）（图3D、L、M）；TBI组突触结构破坏、突触间隙模糊，水凝胶组突触结构完整，PSD厚度增加（HA/BM组53 nm，SDF@HA/BM组46 nm，TBI组37 nm），SDF@HA/BM组突触间隙宽度（16 nm）显著小于假手术组（25 nm）和HA/BM组（22 nm）（图3E、N、O）。术后42天IBA-1、GFAP和MBP免疫荧光显示水凝胶减轻损伤皮层小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的反应性增生（图3F-H），CD206与IBA-1共定位显示各组M2型小胶质细胞数量无显著差异；术后56天H&E显示TBI组脑组织明显萎缩，水凝胶组改善该现象，SDF@HA/BM组组织形态接近正常。综上，HA/BM和SDF@HA/BM水凝胶均能促进神经元再生、髓鞘和突触形成并缓解胶质增生，SDF@HA/BM水凝胶修复速度更快、组织重塑效果更佳。

图3 .SDF@HA/BM水凝胶促进神经元成熟和脑组织重塑。(A) 如果在治疗35天后针对大脑皮质NeuN和MAP2进行染色(标尺=A1为500μm，A2为200μm)，则(A2)为(A1)中盒式图像的放大。(B)如果治疗42d后大脑皮层GAP43和PSD95的染色(比例尺分别为B1 200μm和B2 50μm)，(B2)为(B1)中盒装图像的放大。透射电子显微镜观察(C)神经元，(D)髓鞘(红色箭头)，(E)突触(黄色椭圆形)的超微结构和形态(比例尺分别为C=5μm，D=2μm，E=5 0 0 nm)。治疗42d后，(F)IBA-1和CD206，(G)胶质纤维酸性蛋白，(H)神经营养因子和基质金属结合蛋白(Scale Bar=200μm)染色。免疫荧光图像定量(I)MAP2阳性区域、(J)Neun阳性细胞和(K)PSD95阳性细胞(n=3)。测量有髓轴突直径(L)、髓鞘厚度(M)、PSD厚度(N)和突触间隙宽度(O)。免疫荧光图像(P)IBA-1阳性面积、(Q)GFAP阳性面积和(R)MBP阳性面积定量(n=3)。

（5）SDF@HA/BM水凝胶通过保护激活的外周免疫细胞免受功能障碍，逆转了TBI急性期的免疫抑制

术后第7天免疫荧光显示TBI后小胶质细胞激活，各实验组IBA-1阳性率无显著差异（图4A、C）；全脑炎症因子检测显示TBI导致TNF-α、IL-1β降低及IL-4、IL-10降低，两种水凝胶逆转该现象（图4E）。术后第1天和第3天检测显示TBI小鼠脑组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10从第1天起即低于假手术组，水凝胶植入提升这些因子表达，SDF@HA/BM组第3天表达更高（图4B、D）。损伤皮层基因分析显示与TBI组相比，HA/BM组和SDF@HA/BM组Ptprc上调2.1倍和2.2倍，Ly6g上调3.9倍和3.3倍，Arg1上调43.6倍和29.3倍，Cd3e上调7.5倍和5.1倍，Cd8a上调4.8倍和4.4倍，SDF@HA/BM组Cd19上调2.6倍（图4F）；同时Il6上调19.4倍和14.4倍，Il1b上调28.1倍和23.0倍，Il10上调3.0倍和3.6倍（图4G）。TBI破坏血脑屏障使循环免疫细胞进入脑实质，但该研究结果显示TBI后脑组织炎症因子降低且外周免疫细胞基因表达受限，推测与免疫细胞耐受和功能障碍相关；HA/BM和SDF@HA/BM水凝胶通过保护免疫细胞免受耐受和功能障碍，对抗急性期免疫抑制，维持适当免疫反应，使炎症因子正常表达并为后续神经修复、组织重塑和功能恢复提供条件。

图4 .SDF@HA/BM水凝胶可对抗脑外伤急性期的免疫抑制作用，上调炎症细胞因子的表达水平。(A) 治疗7d后大脑皮层IbA-1染色(A1比例尺=1000μm，A2比例尺=500μm)，(A2)为(A1)损伤面积扩大。(2)术后1天小鼠全脑组织中炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素4、白介素10、白介素6)的含量。(C)IBA-1阳性区域的定量(n=3)。术后第3天和第7天(n=3)小鼠全脑组织中炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素4、白介素10)的含量。RT-qPCR检测术后7d小鼠局部损伤脑组织免疫细胞(F)标志基因和(G)炎症细胞因子基因的表达水平(n=3)。

（6）SDF@HA/BM水凝胶促进神经再生的体内外分析

体外细胞实验验证SDF-1α促进神经干细胞迁移及HA/BM水凝胶诱导神经元分化的能力。细胞划痕实验显示，100 ng/mL SDF-1α促进贴壁培养NSCs在48小时内划痕愈合，对照组剩余61%初始划痕宽度（图5B、C）；SDF-1α对NSCs增殖无显著影响（图5D），提示其促进NSCs水平迁移。Transwell实验显示，SDF-1α吸引下更多NSCs穿过聚碳酸酯膜进入下室（图5E-H），表明其促进NSCs垂直迁移。NSCs表面表达SDF-1α特异性受体CXCR4，通过SDF-1α/CXCR4轴从室管膜下区和海马齿状回颗粒下层招募至损伤区。

图5. SDF-1α促进神经干细胞迁移。(A) 促进国家安全中心迁移的自卫队-1号α示意图。(B)神经干细胞对sdf-1α水平迁移的体外划痕图像(标尺=200μm)。(C)对特定时间点的划痕宽度进行量化(n=4)。(D)SDF-1α对神经干细胞活力的影响(n=5)。(E)神经干细胞对sdf-1α垂直迁移的Transwell迁移分析示意图。(F)DAPI染色图像和(G)DAPI阳性面积的定量；(H)Transwell迁移试验中的迁移细胞数(Scale Bar=2 0 0μm，n=9)。

HA/BM水凝胶为招募的NSPCs提供神经发生微环境（图6A）。NSCs在HA/BM水凝胶诱导下分化为神经元，表现为Nestin阳性减弱（NSCs减少）和MAP2阳性增强（神经元增多）（图6B、C）；神经元相关基因Tubb3上调3.2倍、Rbfox3上调4.1倍，NSC相关基因Nes上调5.1倍、Sox2下调0.5倍，星形胶质细胞相关基因Gfap和S100b下调（图6D），提示NSCs优先向神经元分化。

图6 .HA/BM水凝胶促进神经干细胞向神经元分化。(A) HA/BM水凝胶诱导神经干细胞分化为神经元的示意图。(B)NSCs抗Nestin和MAP2染色图像(比例尺=200μm)。(C)巢蛋白和MAP2的荧光面积定量(n=3)。(D)RT-qPCR分析神经干细胞神经分化相关基因(n=3)。

术后第3天和第7天Nestin和Tuj1免疫荧光显示TBI诱导NSPCs（Nestin阳性细胞）激活并向损伤区迁移，HA/BM和SDF@HA/BM水凝胶增加损伤区NSPCs数量，SDF@HA/BM效果更显著（图7A、B、E、H）；第3天各组Tuj1阳性细胞数量无差异（图7C、F），第7天SDF@HA/BM组Tuj1阳性神经元更多（图7C、I），SDF@HA/BM组EdU阳性细胞更多，包括NSPCs、神经元及其他细胞（图7D、G、J）。植入的SDF@HA/BM水凝胶内存在Nestin阳性和Tuj1阳性细胞（图7C），提示其提供神经发生微环境，通过招募内源性NSPCs至损伤区并诱导其分化为神经元，为后续神经再生和脑组织重塑奠定基础。

图7 .SDF@HA/BM水凝胶促进NSPC的募集和神经元分化。(A) 治疗3天或7天后(Scale Bar=500μm)大脑皮层Nestin和TUJ-1及EDU标记。(B)DAPI、EDU和Nestin共同标记的新增殖的NSPC(标尺=B1为500μm，B2为100μm)，(B2)为(B1)中盒装图像的放大。(C)DAPI、EDU和TUJ1共同标记的新生神经元(标尺分别为C1500μm和C2100μm)，(C2)为(C1中盒式图像的放大)。(D)EDU标记的新增殖细胞(Scale Bar=500μm)。免疫荧光图像显示(E)Nestin阳性面积、(F)Tuj1阳性细胞和(G)Edu阳性细胞的定量(n=3)。免疫荧光图像显示(H)Nestin阳性面积、(I)Tuj1阳性细胞和(J)Edu阳性细胞的定量(n=3)。