针对上述问题，安徽医科大学李博文团队通过化学合成方法制备了二硒键桥接的前药DSeD，并将其与KGN共包载于纳米颗粒中，形成KGN@DSeD NPs。为了增强药物在关节软骨中的靶向性和保留能力，进一步用软骨靶向肽WYRGRL修饰纳米颗粒，形成W/KGN@DSeD NPs。通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等手段对纳米颗粒的粒径、形态和稳定性进行了表征。在体外实验中，研究者利用氧化应激模型（H₂O₂处理）评估了纳米前药的药物释放行为，并通过细胞实验验证了其对软骨细胞的抗氧化保护作用、抗炎效果以及对软骨基质代谢的调节作用。在体内实验中，采用小鼠骨关节炎模型（DMM手术诱导），通过关节内注射W/KGN@DSeD NPs，评估了其在缓解疼痛、改善关节功能和抑制软骨降解方面的治疗效果。该文章于2025年11月19日以《A Diselenide-Linkage Self-Assembled Nano-Prodrug for Enhanced Osteoarthritis Treatment》为题发表于《ACS Nano》（DOI:10.1021/acsnano.5c12637）。

图1.纳米前药合成与OA治疗机制示意图。（A）DSeD前药分子通过二硒键共价连接两分子DIC的合成路径；（B）KGN@DSeD NPs的自组装构建与DSPE-PEG-WYRGRL表面修饰形成W/KGN@DSeD NPs；（C）纳米前药在关节腔内的作用模式：通过靶向肽结合软骨ECM实现长效滞留，在ROS微环境中二硒键断裂，触发DIC、KGN及硒元素（Se）的协同释放——DIC抑制PGE₂产生以镇痛抗炎，Se激活Nrf2通路清除ROS，KGN促进软骨细胞合成ECM。

（1）W/KGN@DSeD NPs的构建与ROS响应性释药

通过纳米沉淀法，DSeD前药分子自发组装形成均一纳米粒（DSeD NPs），动态光散射（DLS）测得平均水合粒径为180.8 nm，PDI为0.217（图2B）；透射电镜（TEM）证实其球形形貌与结构完整性（图2C）。共包载KGN后，KGN@DSeD NPs粒径增至207.7 nm（图2D）。经DSPE-PEG-WYRGRL修饰后，靶向纳米粒（W/KGN@DSeD NPs）粒径优化为151.4 nm，Zeta电位由负转正（图2H），确认靶向肽成功接枝。HPLC定量显示，KGN的包封率和载药量分别高达72.3%和51.6%。体外释放实验表明，在1 mM H₂O₂模拟OA微环境中，DIC在12小时内几乎完全释放，KGN释放率达83%；而在生理条件下（无H₂O₂）药物泄漏可忽略不计（图2I-J），证实了优异的ROS响应性。

图2.纳米前药的表征与ROS响应性药物释放。（A）W/KGN@DSeD NPs的构建流程；（B）DSeD NPs的DLS粒径分布（Z-Average=180.8 nm）；（C）DSeD NPs的TEM图像；（D）KGN@DSeD NPs的TEM图像；（E）W/KGN@DSeD NPs的TEM图像；（F-H）Zeta电位变化与UV-Vis光谱；（I）DIC在不同条件下的体外释放曲线；（J）KGN在H₂O₂刺激下的控释行为。

（2）细胞摄取、生物相容性与抗氧化机制

以吲哚菁绿（ICG）为模型药物的摄取实验显示，W/ICG@DSeD NPs在6小时被软骨细胞摄取的阳性率达55.7%，显著高于游离ICG（图3A-B）。CCK-8及活/死细胞染色证实，纳米粒在5天内对细胞无明显毒性（图3C）。在IL-1β诱导的炎性软骨细胞模型中，W/KGN@DSeD NPs显著促进Nrf2核转位（图3F），并上调下游抗氧化酶HO-1和NQO1的表达（图3E），效果优于阳性对照药RTA-408。DCF荧光探针检测显示，该纳米粒几乎完全清除细胞内ROS（图3B）。

图3.细胞摄取、生物安全性与体外抗氧化机制。（A）不同时间点（2 h、6 h）软骨细胞对纳米粒的摄取共聚焦图像；（B）流式细胞术定量分析细胞摄取效率；（C）CCK-8检测各组细胞活力；（D）Se介导的Nrf2抗氧化通路示意图；（E）Western blot检测HO-1、NQO1蛋白表达；（F）Nrf2核-质分布的Western blot分析。

（3）体外软骨保护、抗炎与关节腔滞留

W/KGN@DSeD NPs显著上调COL2和ACAN的表达，同时抑制降解酶MMP-13和ADAMTS-5（图4D），逆转IL-1β诱导的分解代谢表型。ELISA检测显示，该纳米粒对疼痛相关炎症介质PGE₂的抑制效果显著优于游离DIC（图4E）。Cy5标记的活体成像显示，W/Cy5@DSeD NPs因WYRGRL肽与软骨Ⅱ型胶原的特异性结合，在关节腔内维持强荧光信号直至第28天，显著优于非靶向组（图4F）。

图4.体外治疗 efficacy 与关节腔滞留。（A）Nrf2免疫荧光染色显示核转位；（B）DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；（C）软骨代谢相关蛋白的Western blot分析；（D）PGE₂浓度ELISA检测；（E）Cy5标记纳米粒在关节腔内的荧光滞留图像（0-28天）。

（4）体内治疗效果与功能恢复

在DMM手术诱导的小鼠OA模型中，W/KGN@DSeD NPs展现出优异的治疗潜力（图5A）。术后第4周，该组的机械疼痛撤足阈值（PWT）显著高于PBS组和单药治疗组（图5B），几乎恢复至假手术水平；旷场实验显示其运动距离及平均速度显著优于其他组（图5C-D）。Micro-CT显示该组软骨下骨结构完整，骨赘形成显著减少（图5E）。Safranin O-Fast Green染色显示（图5F），W/KGN@DSeD NPs组软骨表层结构完整、糖胺聚糖（GAG）含量丰富，OARSI评分最低；免疫组化证实该组COL2表达最高，MMP-13表达显著降低（图5G-H）。

图5.体内治疗效果评估。（A）动物实验流程示意图（DMM建模及给药方案）；（B）机械疼痛撤足阈值（PWT）测定；（C-D）小鼠运动距离与平均速度分析；（E）Micro-CT三维重建显示关节骨赘与软骨下骨结构；（F）Safranin O-Fast Green软骨染色；（G-H）COL2与MMP-13免疫组化染色。

（5）转录组学揭示深层机制

对W/KGN@DSeD NPs治疗组的软骨组织进行RNA测序，与PBS组相比，共有5668个差异表达基因（2988个上调，2680个下调）（图6C）。GO富集分析显示，ECM组织、抗氧化反应及结缔组织发育等生物过程显著激活（图6D）。KEGG通路分析揭示，纳米粒处理显著上调ECM-受体相互作用及PI3K-Akt生存通路，同时抑制NF-κB炎症通路及破骨细胞分化（图6E）。

图6.转录组学分析。（A-B）差异基因火山图（ vs. PBS组）；（C）韦恩图展示差异基因交集；（D）GO功能富集分析；（E）GSEA通路富集分析（FoxO、TNF、ECM-受体相互作用等通路）。