针对上述问题，武汉理工大学戴红莲团队与武汉大学喻爱喜团队开发了一种负载聚柠檬酸（PCA）的明胶-硫辛酸（Gel-LA）微凝胶，并将其填充入取向电纺纤维导管中，构建了一种新型神经组织工程支架。该系统通过取向纤维为轴突生长提供物理引导，利用微凝胶的级联孔隙结构促进细胞浸润和营养传输。更重要的是，研究利用PCA高效螯合Fe²⁺的特性，有效降低了损伤部位的铁离子水平，从而抑制了铁催化的氧化应激反应。实验结果表明，该导管能显著缓解线粒体和内质网应激，保护线粒体功能并提升能量代谢，同时促进血管新生。在大鼠坐骨神经切断模型中，该支架成功改善了神经形态和功能恢复，证明了通过PCA调节铁稳态微环境是促进周围神经再生的有效策略。该文章于2026年1月1日以《Poly(Citric Acid) Bidirectional Regulator: Coordinating Iron Homeostasis to Suppress Stress Responses and Boosting Mitochondrial Bioenergetics for Enhanced Nerve Repair》为题发表于《Advanced Materials》（DOI:10.1002/adma.202507931）。

图1 生物活性PCA神经支架构建及改善周围神经再生微环境的机制示意图。PCA通过螯合损伤部位过量的Fe²⁺缓解细胞应激、促进能量代谢及血管生成；微凝胶的级联孔隙结构为神经再生相关细胞提供生长空间；该支架能有效促进SD大鼠PNI后的神经再生及运动功能恢复。

（1）P(MMD-CL)的材料表征

为改善聚己内酯（PCL）的亲水性，将吗啉-2,5-二酮（MMD）与ε-己内酯共聚合成P(MMD-CL)（图2A）。经静电纺丝制备的P(MMD-CL)纤维膜表现出均匀的取向和一致的纤维直径（平均770.69 ± 139.71 nm），且无串珠结构（图2B-D）。随着MMD比例的增加，材料的亲水性显著提升（图2E,F），且P(MMD-CL8)在改善亲水性的同时也保持了良好的机械性能。通过柠檬酸（CA）和甘油的高温热聚合反应合成了聚柠檬酸（PCA）（图2G）。PCA在水溶液中主要以聚集态存在（图 2H），并在脂肪酶存在下表现出较高的结构稳定性，7周内降解为单体的比例仅为4.70%（图 2I）。PCA具备浓度依赖性的Fe²⁺螯合能力（图 2J），且在掺入Gel-LA水凝胶后仍保留显著的螯合效应（图 2K）。此外，富含羧基和羟基的PCA显示出优异的抗氧化特性，能有效清除DPPH（图 2L）和OH·自由基（图 2M）。利用明胶和硫辛酸合成光敏前体Gel-LA，通过两步光交联法制备了微凝胶水凝胶（图 2N）。流变学结果显示该水凝胶呈现弹性固体行为（图 2O），PCA的加入未显著改变其网络结构。尽管微凝胶水凝胶的整体抗压性低于本体水凝胶（图 2P），但其渗透性显著增强，液体可在1.35秒内完全通过（图 2Q）。扫描电镜（SEM）显示其具有分级孔隙结构，包含微凝胶球体、模块间孔隙及内部微孔（图 2R），有利于细胞浸润。该微凝胶体系具备自愈合能力（图 2T），将其注入P(MMD-CL8)导管并经紫外光照交联后，可形成具有内聚力的填充型神经导管支架（图 2U）。

图2 生物活性PCA神经支架的合成与表征。（A） P(MMD-CL)的合成反应式；（B） 取向电纺纤维膜示意图；（C） P(MMD-CL)纤维膜的SEM图像；（D） P(MMD-CL8)纤维直径分布；（E–F） 水接触角统计分析及代表性图像；（G） PCA合成示意图；（H） PCA的DLS粒径分布；（I） PCA在有无脂肪酶条件下的降解率；（J–K） PCA及Gel-LA/PCA的Fe²⁺螯合能力；（L–M） PCA清除DPPH及OH•自由基的活性；（N） 微凝胶水凝胶的制备及凝胶化机理；（O） 水凝胶的流变学性能；（P） 水凝胶的压缩应力-应变曲线；（Q） 微凝胶与水凝胶的液体通过速率对比；（R） 微凝胶水凝胶的SEM图像；（S–T） Gel-LA水凝胶及微凝胶的自愈合性能；（U） 填充Gel-LA/PCA微凝胶的P(MMD-CL8)导管横截面SEM图像。

（2）PCA神经支架修复线粒体的功能验证

细胞毒性及死活染色结果表明浓度低于1 mg/mL的PCA具有良好的细胞相容性。FAS诱导导致细胞内Fe²⁺荧光强度增强（图 3A），而PCA处理显著降低了胞内Fe²⁺水平，其中0.5及1 mg/mL浓度效果最为显著（图 3B）。在氧化应激评估中，PCA处理有效抑制了FAS诱导的ROS水平升高（图 3C, F），并逆转了GSH含量及GPX4活性的下降（图 3G, H），同时低浓度PCA促进了BDNF和NGF的表达（图 S6D）。蛋白印迹分析显示，PCA预处理下调了Caspase-3和Bax的表达，上调了PON1及Bcl-2的表达（图 3D）。线粒体功能检测表明，PCA有效缓解了RSCs线粒体膜电位的下降（图 3E, I），恢复了线粒体呼吸链复合物I和V的活性（图 3J, K），并提升了细胞内ATP水平（图 3L）。OCR分析进一步证实，PCA显著改善了受损细胞的非线粒体呼吸、基础呼吸、最大呼吸能力及ATP生成速率（图 3M, N）。

图3 PCA在铁过载下螯合Fe²⁺并保护线粒体功能。（A–B） FAS及PCA处理后的RSCs形态及不稳态铁池检测；（C，F） 胞内ROS荧光成像及荧光强度统计；（D） PON1、Caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白印迹分析；（E，I） 线粒体膜电位（MMP）的JC-1染色及红绿荧光比值统计；（G–H） 胞内GSH含量及GPX4活性；（J–K） 线粒体呼吸链复合物I及V活性；（L） RSCs的ATP含量；（M–N） RSCs的耗氧率（OCR）测定及呼吸参数分析。

（3）PCA促进血管生成

划痕实验结果表明PCA处理组愈合率显著提高，其中1 PCA组在12和24小时的细胞迁移促进效果最强（图 4A, D, H(a)）。Transwell实验进一步证实了PCA显著增强HUVEC的迁移能力（图 4B, H(b)）。管腔形成实验显示PCA处理组形成了更多的网格和分支结构，定量分析证实1 PCA组具有最多的网格数和节点数，血管生成潜力最佳（图 4C, E, H(c)）。RT-qPCR分析揭示，1 PCA组显著上调CD31和SDF-1α的表达，而0.5 PCA组中VEGF和HIF-1α的表达水平最高（图 4F, G）。该机制表明PCA通过螯合Fe2+减少HIF-1α降解，进而上调VEGF和SDF-1α表达以促进血管生成及神经修复（图4I）。

图4 PCA促进血管生成。（A，D） HUVECs划痕愈合实验及愈合率统计；（B） Transwell细胞迁移实验；（C，E） 管腔形成实验及成管参数（网格和节点数）统计；（F–G） HUVECs中CD31、VEGF、HIF-1α及SDF-1α的基因表达；（H） 划痕、迁移及管腔形成实验示意图；（I） PCA促进血管生成的信号通路机制示意图。

（4）PCA减轻周围神经修复过程中的炎症反应并缓解线粒体及内质网应激

术后一周的免疫荧光及RT-qPCR分析显示，与Hyd组相比，Hyd_PCA组中NF-κB和TNF-α的荧光强度及基因表达水平显著降低，表明PCA有效抑制了早期炎症反应（图 5A, E）。在内质网应激评估中，Hyd_PCA组近端神经断端的GRP78和p-PERK表达显著下调，同时Nrf-2表达增强（图 5B）；免疫组化及RT-qPCR结果进一步证实，Hyd_PCA组中ER应激相关蛋白（CHOP, XBP-1, IRE-1α）及基因（ATF-6, PERK）表达水平均显著低于Hyd组（图 5C, F, G）。此外，Hyd_PCA组中Bax和Cyt-c等促凋亡蛋白水平降低，而Bcl-2抗凋亡蛋白表达上调，提示线粒体依赖性凋亡通路受到抑制（图 5D, H）。线粒体功能相关基因分析表明，该组HO-1表达升高，SOD2和CAT表达下降（图 5I），同时线粒体DNA修复基因POLG和OGG-1表达上调（图 5J），证明PCA通过缓解氧化应激和内质网应激有效保护了线粒体功能。

图5 PCA减轻周围神经修复过程中的炎症反应并缓解线粒体及内质网应激。（A–B） 术后1周近端神经中TNF-α、NF-κB、GRP78、p-PERK及Nrf-2的免疫荧光染色；（C，F） 内质网应激相关蛋白（CHOP、XBP-1、IRE-1α）的免疫组化染色及半定量分析；（D，H） 线粒体应激相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cyt-c）的免疫组化染色及半定量分析；（E，G） NF-κB、TNF-α、ATF-6及PERK的基因表达；（I–J） 术后1周近端神经断端中SOD2、CAT、HO-1、POLG及OGG-1的基因表达。

（5）验证PCA在周围神经修复中促进血管和神经再生

术后一周的免疫荧光分析表明，Hyd_PCA组及自体移植组近端神经节段中HIF-1α与SDF-1α的蛋白表达显著高于Hyd组（图 6B, D）；同时，Hyd_PCA组的VEGF及CD31阳性区域显著增加，显示出更清晰的血管网络（图 6C, E）。神经再生过程评估（图 6A）及NF200、S100免疫荧光染色结果显示（图 6F, G），术后第一周Hyd_PCA组再生神经轴突生长速率显著快于对照组（图 6H）；至第三周，该组中成熟施万细胞数量增多且向远端延伸更长（图 6I）；至第四周，Hyd_PCA组再生轴突成功连接至远端神经，而Hyd组仅表现出较少的神经纤维再生及施万细胞分布。

图6 PCA在周围神经修复中促进血管和神经再生。（A） 周围神经再生示意图；（B，D） 术后1周近端神经中HIF-1α及SDF-1α的免疫荧光染色与统计；（C，E） CD31及VEGF的免疫荧光染色与统计；（F–G） Hyd组及Hyd_PCA组术后1至4周再生轴突NF200/S100的免疫荧光染色；（H–I） NF200及S100的荧光强度统计。

（6）术后1周大鼠近端神经断端的RNA测序及机制分析

术后1周大鼠近端神经断端的RNA测序结果显示，样本间具有高度一致的基因表达模式，共鉴定出1776个差异表达基因，其中1558个上调，218个下调。KEGG富集分析表明，差异基因主要富集于抗炎抗氧化（PPAR及IL-17信号通路）、血管成熟、能量代谢（脂肪细胞因子、AMPK信号通路及脂肪酸降解）及神经再生相关通路（图 7A）。线粒体生物能量学分析显示，氧化磷酸化、TCA循环及脂肪酸降解途径中的关键基因（如Ndufs1、Atp5f1a、Cs等）协同上调，证实了PPAR和AMPK信号轴的激活。基因关联网络分析揭示，Adora1的上调有助于缓解氧化应激与炎症，而Aplnr和Lep的上调则提供了神经营养支持（图 7B）。GO分析进一步证实差异基因与炎症、细胞黏附、氧化应激及能量代谢过程高度相关（图 7C），网络图谱显示离子转运及离子通道活性相关基因显著上调（图 7D）。此外，GSEA分析表明抗氧化、ATP合成及钙离子结合等生物学过程得到显著增强（图 7E, F），神经活性配体-受体相互作用通路相关标志基因亦表现出明显上调。

图7 术后1周大鼠近端神经断端的RNA测序及机制分析。（A） KEGG富集分析散点图；（B） KEGG通路的基因-概念网络图；（C） GO富集分析条形图；（D） GO术语的基因-概念网络图；（E–F） GO术语及KEGG通路的GSEA富集分析。

（7）术后12周神经再生功能的评估

术后12周评估显示，Hyd_PCA组腓肠肌萎缩程度显著低于Hyd组，肌肉湿重比更高（图 8A, B），且胶原沉积减少，肌纤维排列整齐（图 8C, D）。神经肌肉接头（NMJ）染色显示Hyd_PCA组呈现成熟的“椒盐卷饼”状形态，接近自体移植组。电生理及步态分析表明，Hyd_PCA组的神经传导速度、CMAP波幅及坐骨神经功能指数（SFI）均显著优于Hyd组（图 8E-H）。组织学分析显示，Hyd_PCA组NF200和S100阳性区域显著增加；TEM及LFB/TB染色证实该组再生轴突直径、髓鞘厚度及密度均显著高于Hyd组，且炎症反应轻微，各项指标接近或达到自体移植组水平（图 8I-N）。至术后16周，Hyd_PCA组在神经形态结构、髓鞘密度、肌肉萎缩恢复及步态轨迹方面均与自体移植组相当；电生理指标差异进一步缩小，CMAP潜伏期无显著差异，且S100及NF200表达水平甚至略高于自体移植组，证实该支架可实现长期的形态与功能修复。

图8 术后12周神经再生功能的评估。（A–B） 腓肠肌代表性图像及湿重比统计；（C–D） 腓肠肌Masson染色及胶原沉积面积统计；（E，G–H） 再生神经电生理评估、神经传导速度及CMAP波幅统计；（F） 大鼠足迹图像；（I） 再生轴突不同部位截面的TEM图像；（J–K） 平均轴突直径及髓鞘厚度统计；（L） 神经组织H&E、LFB及TB染色图像；（M–N） 髓鞘及施万细胞阳性面积统计。

（8）PCA调节周围神经再生微环境的机制

严重神经损伤导致的铁代谢紊乱使局部Fe²⁺浓度升高，进而通过芬顿反应产生OH•并加剧氧化应激（图 9）。PCA凭借其富含羧基和羟基的超支化结构，表现出显著的Fe²⁺螯合与自由基清除能力。体内研究表明，PCA通过捕获游离Fe²⁺有效降低ROS介导的氧化损伤及细胞凋亡，并通过调节抗炎、ATP生成及轴突导向等通路缓解内质网和线粒体应激。该机制保护了线粒体功能以维持持续能量供应，同时促进血管化，最终实现了周围神经形态与功能的全面恢复。

图9 PCA调节周围神经再生微环境的机制示意图。PCA通过螯合Fe²⁺抑制铁诱导的羟基自由基形成及ROS产生，发挥抗氧化作用并减少细胞凋亡；同时通过缓解线粒体及内质网应激、促进能量供应、抑制炎症反应并增强血管化，从而改善再生微环境并促进周围神经修复。