针对上述问题，陆军军医大学罗高兴团队联合南通大学附属医院张逸团队构建了一系列具有微米级周期拓扑结构的支架，用于系统探讨骨髓来源MSCs（BMSCs）旁分泌功能与拓扑结构之间的调控规律及其机制，并验证其在深Ⅱ度烧伤创面修复中的效果。该文章于2025年06月21日以《Topology scaffolds-enhanced paracrine of BMSCs through mechanotransduction-related metabolism reprogramming for burn wounds healing》为题发表于《Biomaterials》（DOI： 10.1016/j.biomaterials.2025.123518）。

研究示意图.拓扑支架促进 BMSCs 旁分泌功能修复深 II 度烧伤创面

（1）拓扑结构支架的制备与表征

既往研究表明拓扑结构可上调骨髓间充质干细胞（BMSCs）旁分泌功能，但二者关联的通用规律尚未明确。研究设计条纹（Stripe）、波浪（Wave）、柱状阵列（Pillar array）三种经典拓扑支架，特征尺寸为数十微米，虽微观形态不同，但均遵循周期性离散分布设计原则以实现一致的细胞铺展调控效果，支架基本参数确保形状为研究核心变量（图 2b、c）。选用低分子量 ε- 聚己内酯（PCL）为基材，采用毛细管印刷法制备 PCL 拓扑支架：将 PCL 液滴浇铸于 PDMS 模具，80℃下自平整后室温冷却脱模（图 1a）。通过扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）及纳米压痕仪表征支架固有属性，结果显示：平面 PCL 支架表面光滑，表面粗糙度 Ra≈25.0 nm（图 1b、c），杨氏模量 E≈1.0 GPa（图 1d）；拓扑 PCL 支架则呈现 10.0 μm 级特定微观结构，表现为周期性条纹、波浪及柱状阵列（图 1ei-iii），所有微结构高度均为 5.0 μm（图 1fi-iii）。上述拓扑支架用于探究拓扑结构介导 BMSCs 旁分泌功能的潜在规律与机制。

图1 PCL 拓扑支架的制备、微观形貌及力学性能。（a）PCL 拓扑支架的制备流程示意图；（b）平面 PCL 支架的 SEM 图像；（c）平面 PCL 支架的 AFM 图像；（d）PCL 支架的载荷 - 深度曲线；（e）PCL 拓扑支架的形貌：条纹阵列（ei）、波浪阵列（eii）和柱状阵列（eiii）的三维干涉图像及对应 SEM 图像；（f）PCL 拓扑支架上拓扑结构沿 x 轴的表面轮廓图。

（2）拓扑结构支架介导的BMSCs铺展抑制与旁分泌功能增强

拓扑支架的周期性微观结构通过黏附区Sa与弱黏附区Sw的空间比例调控BMSC形态与尺寸（图2ai）；黏附力（拉伸）与膜张力（收缩）的动态平衡参与细胞行为调控（图2aii）。Sa定义为黏附区域，Sw定义为弱黏附区域（图2b）；条纹与柱状支架Sa≈30%，波浪支架Sa最低（7.1%）（图2c）。F-actin/核染色显示，拓扑结构使细胞呈条纹或不规则形，铺展面积下降>50%，面积排序：条纹<柱状<波浪<平面（图2d、e）；除波浪组因结构-细胞尺寸失配出现偏离外，骨架受限程度与Sa占比呈正相关，提示相对尺寸为关键变量。拓扑组骨架长宽比提升>1.39倍，条纹组峰值6.92±2.25（图2f）；核面积及长宽比变化与骨架同步，表明核形依赖骨架调控（图2g、h）。铺展面积与Sa占比呈非线性相关，同样受结构-细胞尺寸失配影响。Live/Dead、CCK-8及EdU显示，各组存活率无差异，拓扑组活力高于平面；72 h内拓扑结构促进增殖，36 h时EdU⁺比例达峰，排序：平面<柱状<条纹<波浪（图2i-j），证实PCL拓扑支架生物相容性良好。ELISA检测修复相关因子：VEGF、HGF、bFGF、IGF均检出，EGF、IL-10低于检测限；拓扑组VEGF、HGF、bFGF均显著高于平面，IGF仅柱状组升高（图2l-o）；旁分泌增强能力排序：平面<波浪<条纹<柱状。

图2 拓扑支架相关 BMSCs 的形态及旁分泌功能演变。（a）基于拓扑结构的 BMSCs 有限铺展示意图；（b）依赖黏附强度的拓扑支架特征区域示意图；（c）拓扑支架特征区域占比；（d）平面、条纹阵列、波浪阵列及柱状阵列支架上 BMSCs 的荧光图像；（e）支架上 BMSCs 的细胞骨架面积统计图；（f）支架上 BMSCs 的细胞骨架长宽比；（g）支架上 BMSCs 的细胞核面积统计图；（h）支架上 BMSCs 的细胞核长宽比；（i）BMSCs 的 EdU 染色免疫荧光图像（24 h）；（j）BMSCs 接种到拓扑支架后 24、36、72 h 的 EdU + 细胞占比；（k）拓扑支架上 BMSCs 的旁分泌过程示意图；（l-o）不同支架上 BMSCs 分泌 VEGF（l）、HGF（m）、bFGF（n）及 IGF（o）的旁分泌细胞因子水平。

（3）拓扑支架介导的细胞骨架相关机械传导

PCA显示拓扑组与平面组基因表达分离显著，拓扑组间差异小（图3a）。相较平面组，拓扑组下调基因>800个，上调200–400个，柱状组DEGs最多；三组共有DEGs 718个（39.32%），其中上调105个、下调613个（图3b）。火山图筛选出机械传导相关显著上调基因Vcl、Acta2、Myl9、Mylk，下调基因Rac2、Mmp12、Itgam、Itgb2（图3c）；前20共有上调基因的强度排序波浪<条纹<柱状，与铺展面积及旁分泌增强趋势一致，提示骨架-机械传导轴驱动旁分泌（图3d）。RT-qPCR证实Acta2在柱状组显著上调，ROCK、Itgb1轻微下调，Vcl无差异（图3e）。SEM显示拓扑组细胞自发收缩并形成局部黏附，单位细胞丝状伪足数量减少而长度不变（图3f、g）；条纹组接触点极化最显著，极化度：条纹>平面>波浪>柱状。F-actin免疫荧光表明拓扑组MFI高于平面，单位面积承受机械力增大（图3h、i）。Vinculin免疫荧光显示FAs主要分布于细胞边缘，拓扑组单位细胞FA数量减少、面积不变，分布呈极化（条纹、波浪）或均匀（平面、柱状），vinculin总量显著升高（图3j–l）。

GO富集显示共有上调基因集中于信号转导与细胞过程（图4a）。KEGG表明拓扑组同步上调黏着斑、肌动骨架调控及血管平滑肌收缩通路，下调TNF、NF-κB、破骨分化及吞噬体通路，提示BMSC未引发炎症且抑制自发分化（图4b）；VEGF、PI3K-Akt通路未显著富集，提示旁分泌增强主要源于翻译后修饰。GSEA最显著上调条目为肌动球蛋白结构组织、胶原ECM及乙酰辅酶A代谢（图4c–e）；马达蛋白与内质网蛋白加工通路同步上调，协同促进生长因子表达（图4f、g）。丙酮酸代谢在条纹与柱状组增强（图4h）；Acly、Acaca、Acta2、Cnn1、Itgb1、Tgfb3等核心基因聚类上调（图4i）。

图3 拓扑支架介导的细胞骨架相关机械传导。（a）不同组别的基因表达主成分分析（PCA）；（b）不同拓扑支架组间差异表达基因（DEGs）的韦恩图；（c）各组基因表达火山图；（d）组间共表达上调的前 20 个基因热图；（e）机械传导相关 mRNA 的实时荧光定量 PCR检测结果；（f）拓扑支架上 BMSCs 的 SEM 图像；（g）不同支架上单个细胞的丝状伪足数量；（h）不同支架上 BMSCs 应力纤维的免疫荧光图像；（i）不同组间应力纤维的标准化平均荧光强度；（j）不同支架上 BMSCs 黏着斑蛋白（vinculin）的免疫荧光图像；（k）不同支架上 BMSCs 的单个细胞黏着斑（FAs）数量统计图；（l）不同组间黏着斑蛋白（vinculin）表达的标准化平均荧光强度。

图4 机械传导调控的 BMSCs 代谢。（a）共表达上调基因的 GO 术语富集分析；（b）共表达上调基因的 KEGG 富集分析；肌动球蛋白结构组装（c）、含胶原蛋白细胞外基质（d）、乙酰辅酶 A 代谢过程（e）的基因集富集分析（GSEA）；（f-h）KEGG 信号通路（黏着斑（FAs）（f）、内质网（ER）蛋白质加工（g）、丙酮酸代谢（h））的基因集富集分析（GSEA）；（i）（c-e）中 GO 术语对应的核心亚基热图。

（4）拓扑结构支架介导的代谢重编程增强BMSCs旁分泌功能

Seahorse检测显示，拓扑组ECAR峰值显著高于平面，糖酵解、糖酵解能力及储备同步升高，柱状组增幅最大（图5a–d）。OCR实时记录表明，条纹与柱状组最大OCR高于平面与波浪，基础呼吸、最大呼吸及备用呼吸能力亦显著增加，排序：平面≈波浪<条纹<柱状（图5e–h）。综合代谢（糖酵解+OXPHOS）排序相同，且与旁分泌因子表达量正相关。TEM观察证实拓扑组线粒体融合、嵴致密；定量四项形态指标（面积、嵴长度、板层嵴比例、数量）均拓扑组>平面组，柱状组最高（图5i–m），与OCR结果一致。无血清条件下，BMSC依赖线粒体合成非必需氨基酸以供旁分泌因子合成。RT-qPCR示Gls、PYCR1/2、Aldh18a1、Fermt2呈升高趋势但无统计差异（图5n）；WB证实GLS、PYCR1/2及kindlin-2显著上调，P5CS无差异，提示谷氨酰胺-脯氨酸轴增强，且kindlin-2可入线粒体稳定PYCR1（图5o）。综上，拓扑支架经骨架-机械传导轴重编程能量代谢与线粒体氨基酸合成，绕过经典信号通路，直接提升旁分泌输出（图5p）。

图5 机械传导通过代谢与生物合成重编程增强旁分泌的分子机制。（a）不同组 BMSCs 的细胞外酸化率（ECAR）；（b）不同组 BMSCs 的糖酵解水平；（c）不同组 BMSCs 的糖酵解能力；（d）不同组 BMSCs 的糖酵解储备；（e）不同组 BMSCs 的氧消耗率（OCR）；（f）不同组 BMSCs 的基础呼吸水平；（g）不同组 BMSCs 的最大呼吸水平；（h）不同组 BMSCs 的备用呼吸容量；（i）BMSCs 的透射电镜（TEM）图像及区域（ROI）放大图；（j）不同组 BMSCs 的线粒体面积统计图；（k）不同组 BMSCs 的线粒体嵴长度统计图）；（l）不同组 BMSCs 中层状嵴线粒体的占比；（m）不同组 BMSCs 中每个线粒体的层状嵴数量；（n）脯氨酸生物合成相关基因的表达热图；（o）脯氨酸生物合成相关蛋白的 Western blot（WB）检测结果；（p）拓扑支架诱导旁分泌增强的分子机制示意图。

（5）多功能旁分泌细胞因子有效促进深 II 度烧伤创面修复

HUVEC划痕实验显示，拓扑组条件培养基（CM）48 h内迁移速度持续高于平面及阴性对照，24 h起闭合率领先且组间差异不显著（图6a、b）；6 h管形成实验，拓扑组网结数量>平面组>对照组（图6c–e）。L929成纤维在无血清条件下第3天起出现死亡，第5天阴性组大量死亡，拓扑组仅零星死亡；CCK-8证实拓扑组5 d增殖率高于平面及对照（图6f–h）。LPS诱导Raw264.7为M1表型后，拓扑组CM处理12 h，iNOS、CD86荧光强度下降，Arg1、CD206升高，WB结果一致（图6i–m），表明该旁分泌体系可抑制促炎并诱导M2极化；体外效应与因子表达量正相关，拓扑组间无差异。

深Ⅱ度烧伤SD大鼠模型（Ø8 mm）于伤后24 h起连续5 d皮下注射200 μL CM，7、14、21 d取样（图7a）。21 d创面愈合率：拓扑组≈78 %，>平面组>对照组，组间无差异（图7b、c）。H&E示拓扑组21 d再上皮化率100 %，平面66.71±2.90 %，对照62.86±9.27 %；拓扑与平面组可见毛囊及汗腺，对照仅见毛囊（图7d、e）。MT胶原面积：拓扑77–80 %，排列致密；平面67.83±1.25 %；对照41.21±3.18 %，排列松散（图7f、g）。免疫组化7 d：条纹组TNF-α⁺细胞50.83±3.78 %<平面65.96±4.82 %<对照89.10±4.04 %；IL-4⁺细胞42.48±5.93 %>平面20.23±3.66 %>对照11.63±2.15 %（图7h–j）。14 d CD31⁺：条纹68.86±3.61 %>平面43.87±3.23 %>对照29.53±3.75 %（图7h、k），与体外数据一致。

图6 旁分泌细胞因子介导的血管生成、抗凋亡、增殖及免疫调控。（a）不同组处理 48 h 后的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移情况；（b）对应（a）的 HUVEC 划痕愈合率；（c）不同组处理 6 h 后的 HUVEC 管形成图像；（d-e）不同组血管网络的网格数（d）和连接点数（e）；（f）不同组旁分泌因子处理 1、3、5 天的 L929 细胞活 / 死染色图像；（g）对应（f）的活细胞占比；（h）不同组旁分泌细胞因子诱导的 L929 细胞增殖率；（i）不同组旁分泌因子介导的 RAW 264.7 巨噬细胞炎症标志物（iNOS、CD86）免疫荧光图像；（j）对应（i）的 iNOS 和 CD86 标准化平均荧光强度（MFI）；（k）不同组旁分泌因子介导的 RAW 264.7 巨噬细胞抗炎标志物（Arg1、CD206）免疫荧光图像；（l）对应（k）的 Arg1 和 CD206 标准化平均荧光强度（MFI）；（m）不同组 iNOS、CD86、Arg1 及 CD206 蛋白的 Western blot（WB）检测结果。

图7 体内深 II 度烧伤创面愈合。（a）深 II 度烧伤创面愈合过程示意图；（b）假手术组、对照组、平面组、条纹组、波浪组及柱状组 21 天内深 II 度烧伤创面愈合照片；（c）对应（b）的各组创面愈合率；（d）21 天后各组深 II 度烧伤创面的 H&E 染色图像；（e）对应（d）的创面上皮化率；（f）21 天后各组深 II 度烧伤创面的 Masson 染色图像；（g）对应（f）的创面胶原蛋白沉积率；（h）烧伤创面组织中 TNF-α、IL-4 及 CD31 的免疫组织化学染色图像；（i-k）对应（h）的 TNF-α+（i）、IL-4+（j）及 CD31+（k）细胞阳性率。