针对上述问题，中南大学湘雅药学院艾可龙教授和中南大学湘雅医院黄琼教授团队设计了一种类内皮型一氧化氮合酶（eNOS）缺陷型二硫化钼（MoS2）纳米材料（MSNO），为脑缺血再灌注损伤（CIRI）提供了多靶点协同治疗方案。该材料以缺陷富集型 MoS2为载体，通过在缺陷边缘 S 位点形成 - SNO 基团、Mo 位点结合 NO 形成 Mo-NO，兼具稳定释放 NO 与高效清除活性氧（ROS）的双重特性，可避免 NO 转化为剧毒的过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），实现 “纯 NO” 的精准递送。MSNO 凭借适宜的纳米尺寸可穿透受损血脑屏障，特异性靶向缺血区域，通过抑制钙超载、保护线粒体功能、缓解内质网应激、阻断 cGAS-STING 通路介导的炎症风暴等多重机制，逆转神经元损伤坏死的恶性循环，显著降低脑梗死面积并改善长期神经功能。该文章于 2025 年 10 月 27 日以《An eNOS-like nanomaterial for specific reversal of cerebral ischemia-reperfusion injury》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-64518-4）。

（1）MSNO改善CIRI的原理

MSNO以缺陷富集MoS₂纳米片为骨架，边缘硫空位巯基化生成–SNO，同时Mo中心配位Mo-NO，实现双重NO负载并保留ROS清除活性；水合粒径84.5 nm的三维花状结构（图1a）可穿透CIRI破坏的血脑屏障并富集于缺血区（图1b）。静脉注射后，病灶内NO在120 h内持续释放，同步清除O₂⁻·与·OH，阻断NO向ONOO⁻转化（图1a）。NO经亚硝基化修饰NMDAR抑制钙内流，靶向线粒体清除mtROS，减少mtDNA漏出；抑制小胶质细胞cGAS-STING通路，阻止M1极化；缓解内质网应激，切断“钙超载-氧化应激-炎症风暴”环路，降低神经元凋亡（图1c）。

图1 MSNO改善CIRI。（a）MSNO的物理化学性质。MSNO表面被-SNO取代，能有效清除ROS，实现NO的稳定释放。（b）MSNO经静脉注射，经脑缺血区毛细血管间隙靶向脑缺血区。（c）MSNO可靶向脑CIRI区，抑制线粒体。

（2）MSNO的合成与表征

MSNO经两步合成：四钼酸铵-硫脲180 ℃水热24 h得缺陷MoS₂纳米花，盐酸活化边缘硫为–SH后，冰浴避光与NaNO₂反应7 h引入–NO（图2a）。DFT计算示Sedge对NO₂吸附能−1.87 eV，N–S键长1.99 Å，而Splane吸附能+1.75 eV无法结合；Sedge向NO₂转移0.20 e⁻，全程ΔG<0，且Sedge-NO可0.45 eV低能垒迁移至Moedge形成Mo-NO（图2b–e）。FTIR 695 cm⁻¹、1576 cm⁻¹出现S–N、N=O峰；XPS N1s 401.7 eV（N–O）、398.8 eV（Mo–N）及S2p –SH峰减弱证实–SNO/Mo-NO共存；TEM示花状颗粒84.5 nm，晶格间距6.25 Å，晶体结构完好（图2f–j）。功能验证：120 h持续释放NO，前24 h线性R²=0.998，GSNO 10 min暴释殆尽；伪SOD活性105 U mg⁻¹，清除O₂⁻·、·OH、H₂O₂；ROS存在下ONOO⁻生成量仅为GSNO的1/22，抗氧化能力优于NAC（图2k–n）。

图2 MSNO的合成与表征。（a）MSNO合成步骤图。（b）*NO2在MoS2的S_plane和S_edge上的吸附能。（c）*NO2在MoS上吸附结构的电荷密度差2S_edge。（d）PDOS分析了*NO2和*NO2吸附在莎草位点上的价键和分子轨道。（e）利用DFT计算MSNO合成到MSNO释放NO的自由能。（f）MSNO和MS的FTIR光谱（g） MS和MSNO的Mo3p + N1s XPS光谱。（h）质谱和MSNO的S2p XPS谱。（i）MSNO的TEM可视化。(n = 3，生物重复)。比例尺:50 nm和5 nm。（j）MSNO的水动力直径。（k）相同剂量(1mg /mL)下MSNO和GSNO的NO释放行为。（l）MSNO对O2.-的清除能力。（m）ONOO-GSNO、GSNO⁺O^2-、MS⁺O^2-、MSNO⁺O^2-、NAC⁺O^2-的生成能力。（n）MSNO对·OH的清除能力。数据用mean±SE表示(n = 3个独立实验)。

（3）MSNO具有高特异性靶向I/R脑组织，并稳定释放NO

脑I/R损伤使ROS激增、炎症因子释放并激活MMP，紧密连接断裂、基底膜破坏，内皮间隙扩至120 nm（图3a、c、d），为MSNO富集提供病理通道。MCAO 2 h-再灌24 h大鼠模型模拟临床再通（图3b）。FITC-MSNO舌下静脉注射1 h即在损伤脑区荧光升至假手术组27倍，健康脑区几乎无信号（图3e）；ICP-MS测得损伤侧Mo含量6 h达峰值（假手术组25倍），随后递减，提示靶向聚集并可降解（图3f）。损伤区NO浓度1 h后维持平稳，健康区几乎为零（图3g、h）。GSNO因无靶向，在血流丰富区NO更高且15 min骤降；ROS存在下GSNO组ONOO⁻为假手术组6.67倍，MSNO组因同步清除ROS而显著降低（图3i、j）。GSNO使大鼠血压15 min内降50%，MSNO对系统血压无影响（图3k、l）。

图3 MSNO具有高特异性靶向I/R脑组织，并稳定释放NO。（a）CIRI期间BBB损伤图。（b）MCAO模型图。（c）脑组织毛细血管的TEM图像。(n = 3，生物重复)。比例尺:500 nm。（d）I/R脑组织毛细血管内皮间隙统计图。 （e）注射FITC-MSNO后1h Sham组和I/R组大鼠脑、心、肝、脾、肺、肾的亮场和荧光代表性图像。(n = 3，生物重复)。（f）用ICP-MS检测静脉注射MSNO后不同时间点Sham组和I/R组脑组织Mo含量。（g, h）脑梗死NO水平的代表性图像(g)及定量统计(h)小动物成像技术检测到的不同时间点的区域。比例尺:3 mm. i, j脑组织ONOO-水平的代表性图像(j)和定量统计(i)。比例尺:100 μm。（k, l）给予等剂量GSNO和MSNO后SD大鼠收缩压(k)和舒张压(l)随时间的变化。

（4）MSNO有效改善CIRI

MCAO 2 h-再灌模型于再灌前舌下静脉注射MSNO，24 h后TTC染色与神经评分示0.5 mg/kg剂量梗死面积由44.58%降至7.89%，评分接近假手术组（图4a、b）。0.5 mg/kg平行比较中，MSNO梗死面积最小，NAC与GSNO无显著改善，神经评分亦优于MS（图4c–e）。Nissl与HE染色显示MSNO使神经元形态与组织结构恢复，优于MS（图4f、g）。14 d长期观察：mNSS、胶点、圆筒、转角、转棒、Barnes迷宫均示MSNO感觉运动、平衡及空间认知恢复优于MS（图4h–o）；体重回升快，14 d存活率100%，脑含水量降至假手术水平（图4p–r）。Western blot示MSNO上调Claudin-5、Occludin、ZO-1，促进BBB修复（图4s）。

图4 MSNO有效改善CIRI。（a）MSNO治疗CIRI疗效研究流程图。（b）不同剂量MSNO对CIRI大鼠TTC染色的定量统计。（c, d ）0.5 mg/ kg剂量下NAC、GSNO、MS和MSNO处理CIRI大鼠脑组织TTC染色的代表性图像(c)和定量统计(d)。（e）以0.5 mg/kg剂量NAC、GSNO、MS和MSNO治疗CIRI大鼠的神经学评分。（f）不同处理组大鼠脑组织代表性尼氏染色图(红色箭头表示神经元萎缩，黑色箭头表示组织空泡化)。比例尺:100 μm和20 μm。（g）不同治疗组脑组织代表性HE染色图像。比例尺:100 μm。（h）长期神经功能缺损试验示意图。（i）治疗期间不同治疗组大鼠mNSS平均评分。分数越高，说明损伤越严重。（j, k）粘合剂测试评估老鼠的行为，包括老鼠第一次接触胶带的时间(j)和它成功移除胶带需要的时间(k). （l）圆柱试验评估大鼠前肢使用的不对称性。（m）转角试验结果。（n）Rotarod试验结果。（o）在I/R后第14天，进行Barnes迷宫测试，检测不同治疗组大鼠找到合适洞的时间。（p）不同处理组大鼠14天内体重变化情况。（q）存活率。（r）干湿重法测定梗死半球脑含水量。（s）I/R 1天后受损脑组织中紧密连接蛋白的表达。数据用mean±SE表示(图3a-r, n = 6只/组;图3s, n = 3只/组)。

（5）转录组学分析

对假手术、I/R、MS、MSNO四组脑组织行RNA-Seq：I/R vs 假手术得8419差异基因(DEGs)，MS组降至4530，MSNO组仅477，逆转幅度优于载体（图5a）。火山图示，MSNO vs I/R上调4034、下调3937基因，调控规模大于MS（2924↑/2351↓）；MSNO vs MS另现3380 DEGs（1456↑/1924↓），提示亚硝基化赋予独特表达谱（图5b–d）。GO富集显示MSNO与MS共同干预钙通道、炎症、线粒体、氧化应激、ERS及凋亡六类过程，其中钙通道基因回调最显著（图5e）。热图证实MSNO使六类基因表达回归假手术水平，优于MS。KEGG分析示MSNO对钙信号、线粒体损伤、胞质DNA传感、TNF及NF-κB等通路的抑制效能均强于MS（图5f），奠定其多靶点协同分子基础。

图5 转录组学分析。（a）VENN/UpSetR图形分析显示假手术组、I/R组、ms治疗组和msno治疗组的DEGs。（b）火山图描绘了MS组和I/R组脑组织之间的DEGs。（c）火山图描绘了MSNO组和I/R组脑组织之间的DEGs。（d）火山图描绘了MSNO组和MS组脑组织之间测定的DEGs。（e）生物过程GO富集分析

（6）MSNO抑制神经元线粒体损伤

SH-SY5Y细胞H/R模型示H/R组Ca²⁺升至正常3.45倍，MSNO将其拉回基线，优于仅清除ROS的MS（图6a）；流式验证一致。FITC-MSNO与Mito-tracker共定位Pearson系数0.84，证H/R下靶向线粒体（图6b）。MitoSOX测得H/R mtROS增高3.36倍，MS与MSNO均抑至正常；MSNO使正常MMP细胞占80.26%，ATP产量回升（图6c、d）。大鼠脑I/R组ROS达假手术3.4倍，MDA升高，MSNO显著下调二者。TEM示I/R线粒体肿胀、嵴溶解（图6f），MSNO后结构完整、嵴清晰，接近假手术（图6e、g），表明MSNO经抑制钙超载并清除mtROS保护线粒体。

图6 MSNO抑制神经元线粒体损伤。（a）不同处理组SH-SY5Y细胞Ca²⁺浓度代表性曲线图。比例尺:200 μm。（b）FITC-MSNO与线粒体的代表性图像及共定位分析。比例尺:100 μm。（c）各组SH-SY5Y细胞mtROS (MitoSOX)的代表性图像。比例尺:100 μm。（d）通过JC-1染色评估各组细胞MMP完整性的代表性图像。比例尺:100 μm。 Sham组（e）、I/R组(f)和MSNO组(g)脑组织神经元线粒体的e - g TEM图像。黄色箭头表示线粒体。比例尺:500 nm。数据用mean±SE表示(体外:n = 3个独立实验;体内:每组n = 3只动物)。

（7）MSNO逆转神经炎症

DAPI/dsDNA/Tom20共染显示I/R组神经元mtDNA大量外泄，MSNO显著抑制释放，优于MS（图7a）。免疫荧光示I/R组小胶质细胞以iNOS⁺ M1为主，MSNO降低M1比例并增加CD206⁺ M2（图7b）。I/R脑片cGAS、STING表达上调，MSNO抑制二者激活（图7c、d）。Western blot示I/R组cGAS、STING及下游P-IRF3/IRF3、P-P65/P65升至假手术2倍以上，MSNO下调蛋白表达与磷酸化（图7e–g）。ELISA示MSNO减少IL-1β、IL-6、TNF-α，增加IL-4、IL-10；SH-SY5Y-BV2共培养证实MSNO阻断H/R诱导的cGAS-STING活化及炎症因子分泌，体内外双重抑制神经炎症。

图7 MSNO逆转神经炎症。（a）各治疗组脑梗死区dsDNA/Tom20/DAPI免疫荧光染色。白色箭头表示mtDNA。(n = 3，生物重复)。比例尺:10 μm。（b）iNOS (M1)和CD206 (M2)免疫荧光染色检测梗死区小胶质细胞表型。(n = 3，生物重复)。比例尺:10 μm。（c）各治疗组脑梗死cGAS表达免疫组织化学分析。(n = 3，生物重复)。比例尺:50 μm。（d）各治疗组脑梗死组织STING表达免疫组织化学分析。(n = 3，生物重复)。比例尺:50 μm。（e-g）用WB和代表性图检测脑组织匀浆中炎症相关蛋白的表达水平。数据用mean±SE表示(n = 3只/组)。

（8）MSNO改善ERS并抑制神经元凋亡

MCAO/R后，PBS组脑TG、FFA升高（图7A-B），MDA、4-HNE同步增加（图7C-D）；Exo-Lip下调TG、FFA并减少MDA、4-HNE，幅度优于Exo或Lip单用。油红染色示PBS组脂滴广泛，Exo-Lip组脂滴数量与面积显著回落（图7E-F）。qRT-PCR示Exo-Lip恢复Dagt、CD36表达，抑制Pnlip上调，协同调节脂质代谢基因（图7G-I）。Western blot显示Exo-Lip上调AKT、Nrf2、HO-1，激活AKT/Nrf2/HO-1通路；示意图汇总其通过该通路同步抗氧化与调控脂质代谢（图7J-K）。

图8 MSNO改善ERS并抑制神经元凋亡。Sham组(a)、I/R组(b)、MSNO组(c)大鼠脑神经元ER的a - c TEM图像。黄色箭头表示ER。(n = 3，生物重复)。比例尺:250 nm。(d) ERS和线粒体损伤级联示意图。（e, f）采用q-PCR检测脑组织中ers相关因子的表达水平，包括脑组织Bip (e)、PERK (f)、TUNEL染色。(n = 3，生物重复)。比例尺:50 μm。(h)采用WB法检测脑组织匀浆中凋亡相关蛋白的表达水平。(n = 3，生物重复)。(i)流式细胞术分析不同处理组SH-SY5Y细胞凋亡情况。数据用mean±SE表示(体外:n = 3个独立实验;体内:每组n = 3只动物)。