针对上述问题，山东大学口腔医学院葛少华团队创新性利用绿茶多酚EGCG与米诺环素（MC）通过甲醛介导交联构建模块化自组装纳米颗粒（EM NPs）。这种独特设计赋予纳米颗粒三重智能响应特性：在酸性溶酶体环境中动态调节分子相互作用实现精准药物释放；通过表面电荷反转突破溶酶体囚禁；利用多酚生物粘附靶向蓄积于感染病灶。该文章于2025年6月23日以《Polyphenol-Driven Modular Self-Assembled Nano-Antibiotic for Inflammation Control via Bacterial Infection Clearance and Pyroptosis Inhibition》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202510476)。

研究示意图

（1）EM NPs的物理化学表征

通过甲醛交联EGCG与甲氨蝶呤（MC）共组装制备的EM纳米颗粒呈均匀球形，动态光散射测得粒径约220 nm，透射电镜显示部分颗粒具有中空结构，源于pH调节过程中MC疏水性增强驱动的自组装。该纳米颗粒在4°C条件下可稳定储存至少7天，而在37°C下发生结构坍塌与碎片化，证实其温度敏感的生物降解特性。X射线光电子能谱测得载药量约为30 wt%，且MC的酰胺基和二甲胺基结构保持完整。傅里叶变换红外光谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱证实，EGCG通过酚羟基与甲醛反应形成二聚体、三聚体等多酚框架。分子对接模拟揭示pH依赖的释放机制：pH 7时以氢键为主，而pH 5时MC质子化增强阳离子-π相互作用，减缓药物释放，实现自适应递送。该自组装策略通过非共价相互作用最大程度保留酚羟基，赋予纳米颗粒浓度依赖性的DPPH、羟基自由基和超氧阴离子清除能力。通过类似方法成功构建EGCG-万古霉素、EGCG-阿米卡星等多种抗生素纳米颗粒，验证了该多酚框架递送系统的普适性，为细菌感染及其炎症并发症的综合治疗提供了模块化平台。

图1.EM NPs 的理化性质表征。A）扫描电子显微镜（SEM）图像；B）透射电子显微镜（TEM）图像；C）动态光散射（DLS）粒径分析；D）EM NPs 7 天稳定性分析（n=3）；E）EM NPs 中 C、O、N 元素的 X 射线能谱（EDX）mapping 分析；F）EM NPs 的 N 1s X 射线光电子能谱（XPS）；G）米诺环素（MC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）及 EM NPs 的傅里叶变换红外光谱（FTIR）；H）EM NPs 的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）；I）MC、EGCG 及 EM NPs 的 X 射线衍射（XRD）图谱；J）通过分子对接预测 EM 中分子相互作用；K）EM NPs 在 pH 5.0 和 pH 7.4 条件下的 MC 释放曲线（n=4）；L-N）EM NPs 对 DPPH 自由基（L）、羟基自由基・OH（M）和超氧阴离子O2-（N）的清除能力。数据以平均值±标准差表示。

（2）EM NPs的生物相容性和细胞摄取特性

除了已经提到的优异物理化学性质外，出色的生物相容性对于EM NPs在生物医学应用中的有效利用至关重要。为了确认生物相容性，研究团队在与HGFs（人牙龈成纤维细胞）和THP-1巨噬细胞共培养后评估了细胞活力并进行了活/死染色。在1、3和5天的培养期间，CCK-8测定结果（图2A,B）表明，在低浓度下，EM NPs对HGFs和THP-1巨噬细胞表现出良好的细胞相容性。然而，当浓度分别达到40和80 μg mL-1时，观察到毒性。活/死细胞染色的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像进一步提供了关于细胞存活和增殖的额外见解（图S9，支持信息），与定量结果一致。此外，溶血测定（图2C）显示NPs在所有浓度下均具有出色的血液相容性，溶血率保持在5%以下。这些发现表明EM NPs具有优异的生物相容性，使其适合实际的生物医学应用。随后，罗丹明B用作模型染料标记EM NPs（表示为RB-EM NPs），并使用CLSM监测随时间的细胞摄取。观察结果（图2D,E）显示与EM NPs孵育6小时后荧光强度显著增加，与2小时相比，表明细胞内NPs的积累随时间增加。此外，THP-1巨噬细胞比HGFs表现出更强的内吞能力。

图2.EM NPs 的体外生物相容性、细胞摄取及抗炎免疫调控能力。A、B）通过 CCK-8 法检测不同浓度 EM NPs 与人类牙龈成纤维细胞（HGFs，A）和 THP-1 巨噬细胞（B）共培养 1、3、5 天后的细胞活力；C）EM NPs 的溶血实验代表性光学图像及定量分析（n=5）；D、E）HGFs（D）和 THP-1 巨噬细胞（E）在 2 h 和 6 h 对 EM NPs 的摄取情况；F、G）通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 HGFs 中炎症相关基因（IL-1β、IL-6、IL-8，F）和 THP-1 巨噬细胞中免疫调控基因（IL-1β、IL-8，G）的相对 mRNA 表达水平；H–K）HGFs 中 IL-1β（H、I）和 IL-6（J、K）的代表性免疫荧光图像及定量分析。除非另有说明，所有实验样本量 n=3。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，无统计学差异。

（3）抗菌和生物膜抑制活性

为了验证EMNPs对胞外细菌及生物膜的抑制/清除能力，并探究其抗菌分子机制。研究团队通过菌落计数、活/死染色及电镜观察证实，EM NPs对牙周炎关键致病菌牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）和具核梭杆菌（F. nucleatum）的抗菌率均超99%，与游离甲氨蝶呤（MC）相当，但对细菌细胞膜的破坏更为显著，扫描电镜（SEM）与透射电镜（TEM）显示细菌膜皱缩、内容物泄漏。在清除成熟生物膜方面，EM NPs通过降低生物量、减少厚度并提高死菌比例，表现出优于MC的效能。原核转录组测序（RNA-seq）揭示EM NPs调控P. gingivalis 1107个差异表达基因（DEGs，592个上调、515个下调），显著下调毒力因子PPAD、Kgp、FimA及肽聚糖合成、细胞膜相关基因，KEGG富集分析显示其作用于代谢通路（如肽聚糖、脂多糖合成）和遗传信息过程（如核糖体功能、DNA复制）。分子对接证实EM模块与FimA蛋白通过氢键与疏水作用稳定结合，qRT-PCR进一步验证铁转运蛋白基因FeoB及肽聚糖合成关键酶基因MraY、MurA在EM组显著下调。对胞外细菌与生物膜的高效清除。

图3.EM NPs 的体外抗胞外细菌及抗生物膜活性。A-C）不同处理后牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）和具核梭杆菌（F. nucleatum）的菌落图像（A），及对应的 P. gingivalis（B）和 F. nucleatum（C）抗菌率；D、E）P. gingivalis（D）和 F. nucleatum（E）的活/死细菌染色结果；F、G）不同处理后 P. gingivalis（F）和 F. nucleatum（G）的代表性 SEM 和 TEM 图像（白色箭头指示细胞膜损伤）；H）结晶紫染色的成熟 P. gingivalis 生物膜照片及 I）对应定量分析；J）不同处理 24 h 和 72 h 后 P. gingivalis 生物膜的代表性 3D 图像；K）P. gingivalis 生物膜的活/死细菌比例；L）P. gingivalis 生物膜的平均厚度；M）EM NPs 处理组与 PBS 对照组（Ctrl）相比，P. gingivalis 中差异表达基因（DEGs）的火山图；N）EM NPs 处理后关键致病基因下调的热图；O、P）上调和下调 DEGs 的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；Q）通过分子对接获得的 EM 模块与 FimA 的结合模型；R）不同处理后 P. gingivalis 中 FeoB、MraY、MurA 基因表达的 qRT-PCR 分析。数据以平均值±标准差表示，n=3。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns，无统计学差异。

（4）细胞内抗菌活性

在牙龈卟啉单胞菌感染的THP-1巨噬细胞模型中，EM NPs展现出优异的细胞内抗菌活性。共聚焦显微镜与流式细胞术显示，EM组细菌内化率显著降低至12.4%（PBS组为44.8%）。机制研究表明，EM NPs通过"质子海绵效应"实现溶酶体逃逸：酸性环境中表面电荷反转导致溶酶体pH升高、膜通透性增加，促使纳米颗粒在12-24小时内逐步释放至细胞质。CFU计数证实其时间依赖性杀菌效果，24小时后细胞内细菌活力降至14.33%，远超游离甲氨蝶呤（31.33%）。透射电镜进一步显示，EM NPs不仅破坏细菌结构，还减少了宿主线粒体损伤，体现了对感染细胞的保护特性。

图4.EM NPs 的细胞内抗菌过程及活性。A）细胞内抗菌过程的示意图；B）不同处理后 THP-1 巨噬细胞内荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记 P. gingivalis 的共聚焦图像，空白组为对照（Ctrl），其他组分别为 PBS+P. gingivalis（PBS）、MC+P. gingivalis（MC）、EM NPs+P. gingivalis（EM）；C）FITC 标记 P. gingivalis 的定量分析；D）细胞内细菌荧光强度的流式细胞术分析；E）罗丹明 B 标记 EM NPs（RB-EM NPs）与 THP-1 巨噬细胞孵育 1、3、6、12、24 h 后，RB-EM NPs 与溶酶体的共聚焦共定位图像；F）细胞内 P. gingivalis 菌落图像及 G）对应相对细菌存活率；H）PBS、MC、EM NPs 处理后细胞内 P. gingivalis 的 TEM 表征。数据以平均值±标准差表示，n=3。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；ns，无统计学差异。

（5）EM NPs介导的焦亡抑制

为探究EM NPs减轻感染微环境诱导细胞损伤的机制，对牙龈卟啉单胞菌感染的THP-1巨噬细胞进行RNA-seq分析，发现其调控超过3000个差异表达基因（DEGs），显著抑制线粒体功能障碍、氧化应激及焦亡相关通路。实验验证显示：EM NPs有效减轻焦亡形态学改变，降低乳酸脱氢酶（LDH）释放与IL-1β分泌；MitoSox和JC-1染色证实其清除线粒体ROS（mtROS）、恢复线粒体膜电位；免疫荧光与qPCR表明EM NPs减少mtDNA向胞质释放，机制涉及多酚成分的ROS清除与游离mtDNA物理隔离。进一步研究发现，EM NPs显著抑制AIM2与NLRP3炎症小体表达，流式细胞术检测焦亡细胞比例从PBS组的27.3%降至7.79%，Western blot证实其对AIM2、Caspase-1、GSDMD-N及IL-1β蛋白的抑制作用优于游离MC。综上，EM NPs通过清除mtROS、恢复线粒体功能、减少mtDNA释放并抑制AIM2/NLRP3-Caspase-1-GSDMD通路，有效阻断感染诱导的焦亡，实现杀菌与细胞保护双重功效。

图5.EM NPs 对细胞焦亡的抑制作用及机制。A、B）PBS 组与 Ctrl 组（A）、EM 组与 PBS 组（B）差异表达基因（DEGs）的火山图；C）PBS 组与 EM 组 DEGs 的 KEGG 富集分析；D）EM 组与 PBS 组 DEGs 的热图；E）不同处理后 THP-1 巨噬细胞的代表性焦亡形态变化（红色箭头指示膜泡），空白组为对照（Ctrl），其他组分别为 PBS+P. gingivalis（PBS）、MC+P. gingivalis（MC）、EM NPs+P. gingivalis（EM）；F）不同组 THP-1 巨噬细胞的相对乳酸脱氢酶（LDH）释放量及 G）IL-1β 释放量；H）流式细胞术检测线粒体活性氧（mtROS）；I）线粒体膜电位检测的免疫荧光图像；J、K）不同处理后 THP-1 巨噬细胞中线粒体 DNA（mtDNA）外溢的代表性图像（J）及比例（K）；L）通过 D-loop 或 ND1 引物的 qRT-PCR 检测胞质 mtDNA；M、N）不同处理后 THP-1 巨噬细胞中 AIM2 表达的代表性免疫荧光图像（M）及定量（N）；O）流式细胞术检测不同处理后 THP-1 巨噬细胞的焦亡率；P）Pro-IL-1β、IL-1β、Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N 及 AIM2 的代表性蛋白质印迹（Western blot）图像；Q）GSDMD-N 和 AIM2 的 Western blot 定量结果；R）EM NPs 介导焦亡抑制的示意图。数据以平均值±标准差表示，n=3。*p<0.5,**p<0.01,***p<0.001；ns，无统计学差异。

（6）体内牙周炎炎症和焦亡的抑制

为评估EM NPs的体内治疗效果，研究在C57BL/6小鼠中建立结扎联合牙龈卟啉单胞菌注射的牙周炎模型，并于诱导后2周和4周取材。从影像学、组织学到分子机制三个层面系统评估：骨组织修复方面，micro-CT定量显示EM NPs组在2周和4周时的牙槽骨丧失（CEJ-AB距离）分别仅为PBS组的53.5%和41.7%，显著优于游离甲氨蝶呤（MC）组，且随时间延长促进自然骨再生的优势更突出；H&E和Masson染色证实其能有效恢复牙槽骨结构完整性与胶原纤维致密排列。炎症与焦亡调控方面，免疫组化及荧光成像显示EM NPs较PBS组显著下调牙周组织IL-1β、IL-18炎症因子及AIM2、Caspase-1焦亡标志物，抑制强度约为MC组的2倍，表明其通过双重通路协同减轻病损。安全性方面，主要器官H&E染色未见毒性改变，证实良好生物相容性。综上，EM NPs通过高效抑制炎症与焦亡，有效逆转细菌诱导的骨吸收，在牙周炎治疗中展现出显著优于传统药物的疗效与安全性。

图6.EM NPs 在牙周炎小鼠模型中的体内治疗效果。A）小鼠牙周炎建模及治疗的完整时间线示意图；B）治疗 2 周或 4 周后上颌牙槽骨的三维重建显微计算机断层扫描（micro-CT）图像；C）釉牙骨质界-牙槽骨（CEJ-AB）距离的 micro-CT 定量分析；D）治疗 4 周后牙周组织的苏木精-伊红（H&E）染色及 E）马松三色（Masson）染色图像；F）IL-1β 和 IL-18 表达的免疫组织化学（IHC）染色图像；G、H）治疗 4 周后牙周组织中 AIM2（G）、Caspase-1（H）及 F4/80（巨噬细胞标志物）的免疫荧光染色图像；I、J）IL-1β 和 IL-18（I）、AIM2 和 Caspase-1（J）水平的对应定量分析。数据以平均值 ± 标准差表示，n=6。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

（7）细菌诱导的败血症模型中的治疗能力

通过建立小鼠败血症模型（静脉注射S. aureus），评估EM NPs的全身治疗效果，验证其在全身性感染中的抗菌、抗炎及器官保护作用。通过设计败血症建模-治疗时间线（感染后 2 h 静脉给药），绘制生存曲线（48 h）和体重变化曲线，检测血常规指标（WBC、LYM、NE、PLT）评估免疫状态，血液 CFU 计数检测菌血症控制情况，ELISA 检测血清炎症因子（IL-1β、IL-6），体外荧光成像（IVIS）观察主要器官细菌载量，H&E 染色评估器官病理损伤，长期（28 天）检测评估生物安全性。结果表明，PBS 组小鼠48 h存活率仅 40%，MC 组约 70%，而EM组达 100%；EM 组小鼠体重下降趋势显著缓解，血常规指标（WBC、LYM、NE、PLT）恢复更明显；血液 CFU 计数显示 EM 组细菌存活率显著低于 MC 组；血清 IL-1β、IL-6 水平在EM 组显著降低；IVIS 成像证实 EM 组肝、肺、肾细菌载量显著低MC组；H&E 染色显示 EM 组主要器官（尤其是肝、脾）的炎症浸润和坏死程度显著轻于 PBS 组和 MC 组；28天长期实验表明 EM 组血液生化指标正常，器官无损伤，脾脏 CD86⁺细胞无显著增加（无免疫应激）。这些结果证明 EM NPs 可通过静脉注射实现全身给药，高效清除全身性细菌感染、抑制炎症反应、保护器官功能，且长期安全性良好，为败血症等重症感染治疗提供了新方案。

图7.EM NPs 在重症败血症小鼠模型中的体内治疗效果。A）小鼠败血症模型及治疗的完整时间线示意图；B）不同处理组小鼠的生存曲线（n=10）；C）败血症小鼠的体重变化曲线；D-G）白细胞（WBC，D）、淋巴细胞（LYM，E）、中性粒细胞（NE，F）和血小板（PLT，G）水平变化；H）从血液中培养的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌落图像；I）对应相对细菌存活率；J、K）血清中 IL-1β（J）和 IL-6（K）的表达水平；L）展示主要器官（心、肝、脾、肺、肾）细菌载量的体外荧光图像；M）体外图像中各器官平均荧光强度的定量分析（n=5）；N）不同处理后主要器官的 H&E 染色（黄色箭头指示病理变化部位）。除非另有说明，所有实验样本量 n=6。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；ns，无统计学差异。