针对上述问题，温州医科大学沈贤教授团队构建了“超声-SDT/STING/CXCR4”三模态纳米平台：先系统筛选出含硒新型高效声敏剂，与STING激动剂前药共组装后包覆胶质瘤细胞膜并修饰CXCR4靶向肽，实现肿瘤双重归巢；在超声触发下同步产生活性氧、加速STING激动剂释放并阻断CXCL12/CXCR4轴，从而消融原发灶、激活全身免疫、抑制免疫抑制细胞浸润，显著抑制GBM小鼠原位肿瘤生长、术后复发并延长生存期，为突破GBM免疫屏障提供了超声响应的多功能协同治疗新范式。该文章于2025年11月13日以《A Sono-Responsive Nanoplatform Integrating STING Activation and CXCR4 Blockade for Synergistic Immunotherapy of Glioblastoma》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202512104）。

图1.多功能治疗平台的示意图。协同集成超声触发SDT、STING前药激活及CXCL12/CXCR4轴阻断，增强GBM的协同免疫治疗效果

（1）有机声敏剂的合成与表征

图2a所示三种D–A₁–A₂型分子以三苯胺为供体（D）、苯并酮为受体（A₂）、苯并噻二唑衍生物为第二受体（A₁），X分别取O、S、Se；合成路线为两步Suzuki偶联，先连接4-(二苯胺基)苯硼酸与溴代苯并噻二唑衍生物，再与溴代苯并酮偶联得终产物。纳米沉淀制备的O-NP、S-NP、Se-NP在450–480 nm处呈现最大吸收，640–710 nm处发射峰值（图2b、c）。DFT计算（图2d）显示三种分子均呈扭曲构象，LUMO电子云定域于BP/BZ缺电子单元，HOMO分布于TPA富电子单元，证实高效ICT；TB-S的HOMO–LUMO带隙2.49 eV大于TB-O/TB-Se的2.41 eV，对应其最短吸收波长。

图2.声敏剂的合成与表征。（a）TB-O、TB-S与TB-Se的合成路线及化学结构；（b–c）O-NP、S-NP、Se-NP的紫外-可见吸收与光致发光谱；（d）三者的优化分子几何、HOMO/LUMO电子云分布；（e）能级排列；（f）DPBF在420 nm处相对吸光度随超声暴露时间的变化；（g）Se-NP经TEMP捕获的¹O₂-EPR谱（1 MHz,1 W cm⁻²,40%占空比,5 min）；（h）连续四周期超声后Se-NP的EPR谱；（i）Se-NP与MB在四周期超声中DPBF吸收衰减对比；（j）不同厚度猪肉组织下Se-NP的¹O₂-EPR谱

（2）声动力学性质

DPBF氧化实验（1 MHz，1.0 W cm⁻²，40%占空比，5 min）显示Se-NP的¹O₂产率最高，420 nm吸收下降40%，显著高于O-NP（19%）、S-NP（26%）及MB（13%）（图2f）；DFT计算得TB-Se的ΔE_ST最小，77 K磷光寿命约2.48 ms，提示其ISC效率最优。TEMP-EPR证实Se-NP仅在美国触发下产生典型¹O₂信号，四周期（每周期5 min）后信号强度无衰减（图2g–h）；9 cm厚猪肉组织下¹O₂生成仍保持，显示深层穿透能力（图2j）。

（3）di-MSA-2前药的合成与响应性质

通过二硒系键结合两种STING激动剂（MSA-2），合成了一种新型前药，从而使MSA-2能够选择性释放在ROS过表达的TME中。此外，SDT过程中产生的ROS还能进一步促进前药激活，从而最大限度地减少非靶向副作用。ROS响应的药物释放机制如图3a所示。在ROS存在下，二硒化键可被氧化成亲水的硒氧化物或硒酮，促进邻酯键的水解，从而激活MSA-2。56为研究di-MSA-2中MSA-2的释放特性，采用高效液相色谱（HPLC）监测不同浓度H-2O2处理后的系统。di-MSA-2的保留时间为24.64分钟，MSA-2为3.05分钟。如图3b所示，增加H2O2浓度会导致di-MSA-2对应的峰值逐渐减少，而MSA-2的峰值则增加。HPLC结果证实，二氧化二-MSA-2在H-2-O2处理后实现高效切割，促进了MSA-2的受控释放。

图3.纳米颗粒的表征。a）ROS触发的二-MSA-2前药释放的机制。b）对从二-MSA-2释放的MSA-2进行高效液相色相色相分析，处理不同浓度的H-2O2。代表性的DLS结果和透射电子显微镜图像，c）SeM NPs和d）NPs SeM@GL。比例条：100纳米。e）不同NP的平均尺寸和f）zeta电位。g）不同配方中代表性的CD47和整合蛋白αV表达的西方印迹。数据以均值±标准差（n=3）表示

（4）NP的制备与表征

TB-Se与di-MSA-2经纳米沉淀共组装得SeM NP，同期制备单组分Se NP、M NP；SeM NP表面再包覆GL261胶质瘤细胞膜并插入DSPE-PEG-CXCR4靶向肽（LGASWHRPDK）得SeM@GL NP。HPLC验证CXCR4肽成功修饰；膜涂层使粒径增加≈20 nm（图3c），TEM显示SeM@GL NP呈球形、外周具明显膜层（图3d），平均粒径80–120 nm，ζ电位负值（图3e、f）。Western blot检出膜蛋白CD47、整合素αV（图3g）。37 °C脑组织模拟液中7 d粒径多分散指数无显著变化；正常脑匀浆中MSA-2释放<3 %。1 MHz、1.0 W cm⁻²超声5 min后，HPLC显示MSA-2释放量随照射时间线性升高（图3h），与ROS响应设计一致。

（5）体外细胞靶向与BBB渗透

GL261多细胞3D球体模型（图4a）显示，12 h孵育后SeM@GL NP贯穿20–80 μm深度，荧光强度显著高于SeM NP（图4b、c）。Transwell体外BBB模型（bEnd.3单层上腔、GL261细胞下腔，图4d）中，6 h后下腔GL261细胞内SeM@GL NP荧光信号为SeM NP的3.77倍（图4e、f），表明膜伪装联合CXCR4靶向肽同步增强BBB跨越与肿瘤穿透。

图4.体外NPs抑瘤性能。（a）GL261 3D球体实验示意；（b–c）CLSM观测各NPs穿透50μm球体及定量；（d）BBB Transwell模型示意；（e–f）流式测下室细胞荧光，比较SeM与SeM@GL的跨屏障效率；（g）MTS法检测±US后GL261存活；（h–i）活/死染色（50μm）及定量；（j–k）DCFH-DA探针CLSM（50μm）与ROS定量；（l–m）划痕实验0/36 h前缘迁移（100μm）及统计；（n）Transwell侵袭（100μm）无US组

（6）体外SDT诱导肿瘤细胞杀死效应

CCK-8实验预设参数为1 MHz、1.0 W cm⁻²；2 min照射已使GL261存活率降至最低，延时至5 min无进一步下降，后续体外SDT均沿用该条件。图4g显示，SeM@GL NP+US组（G7）存活率最低（≈25 %），显著低于Se NP+US（G3）、SeM NP+US（G4）及Se@GL NP+US（G5）。Calcein-AM/PI共染色（图4h、i）与上述定量一致，无超声组死亡率<5 %。DCFH-DA探针（图4j、k）表明SeM@GL NP+US组DCF荧光强度为Se NP+US组的1.8倍，ROS产量最高。Annexin V-FITC/PI流式检测显示该组早期+晚期凋亡率合计72.4 %，高于其余各组（图未编号）。伤口愈合实验（图4l、m）中，Se@GL NP与SeM@GL NP组12 h迁移率分别降至22 %和18 %，显著低于PBS组（58 %）；Transwell侵袭实验（图4n）亦显示两种膜包覆且含CXCR4靶向肽的配方穿膜细胞数减少约60 %，证实CXCR4肽对GL261迁移与侵袭的抑制作用。

（7）体外STING激活与细胞免疫反应

GL261细胞经SeM@GL NP+US处理后，免疫荧光显示CRT暴露量为PBS组的12.9倍（图5a、b），HMGB1胞内含量下降83 %并伴随胞外释放增加（图5c、d），证实ICD有效启动。WB显示该组p-TBK1与p-IRF3表达量分别较PBS组提高5.4倍与4.8倍（图5e），ELISA测得IFN-β分泌达（1 620 ± 90） pg mL⁻¹，为各组最高（图5f），表明cGAS-STING通路被显著激活。将经处理的肿瘤细胞与骨髓来源树突状细胞（BMDC）共培养24 h，流式检测显示CD80⁺CD86⁺双阳性比例为62 %，较PBS组提高2.7倍（图5g），说明ICD与STING协同促进DC成熟。

图5.体外免疫激活。（a-b）CLSM（50μm）及定量：Se-NP+US促GL261 CRT外翻；（c-d）CLSM（50μm）及定量：HMGB1核-质释放；（e）Western blot：cGAS-STING蛋白表达；（f）ELISA：24 h IFN-β分泌；（g）BMDC成熟示意图；（h）流式：与处理肿瘤细胞共孵育后CD80+CD86+BMDC比例；均mean±SD，n=3，单因素方差分析

（8）GBM小鼠体内荧光成像

在GL261-Luc正位GBM小鼠模型中，尾静脉注射SeM、SeM@G、SeM@L或SeM@GL NPs后，肿瘤部位NIR荧光信号于≈12 h达峰（图6a,b）。SeM@GL组脑内信号最高，依次为SeM@G、SeM@L；SeM组最低。24 h仍可见SeM@GL的强荧光。离体成像显示，SeM@GL组脑荧光显著高于其余各组，肝脏因RES摄取呈高积累（图6c,d）。GL261膜涂层联合CXCR4靶向提升BBB穿透与瘤内蓄积。

图6.体内分布与疗效。（a-b）NIR活体成像及定量显示SeM@GL脑瘤富集最高（n=3）；（c-d）离体脑/器官荧光证实24 h脑保留（n=3）；（e）治疗时间轴；（f-g）生物发光监测肿瘤生长，SeM@GL+US组信号最低（n=5）；（h）体重无显著差异（n=5）；（i）SeM@GL+US延长生存期（n=8）；（j-l）第30天脑切片H&E、TUNEL（绿/蓝）及定量示该组凋亡最多；数据为mean±SD，双尾t检验(b,d,g,h,i)与单因素方差分析(l)

（9）体内抗胶质瘤对GBM模型的影响

参数预实验显示，SeM@GL NPs静脉注射后以1.0 W cm⁻²、1 MHz、40%占空比照射5 min即可获最大抑瘤收益，8 min无显著增效，故后续固定5 min。GL261-Luc模型第6天起随机分七组（n=5），第6、10、14、18天给药并于12 h后超声。IVIS监测表明，SeM@GL NPs+US组（G7）荧光信号全程最低，第17天仍接近基线；SeM NPs+US（G4）与Se@GL NPs+US（G5）中度抑制，其余四组快速进展（图6f,g）。体重曲线仅G7呈上升趋势，其余组因肿瘤负荷下降或持平（图6h）。生存分析显示G7中位生存>80 d，8只中5只长期存活，显著优于其余各组（图6i）。H&E与TUNEL显示G7肿瘤坏死面积最大、凋亡率最高（图6j–l）。疗效源于SDT直接杀伤、ROS响应释放MSA-2激活STING、双靶向提升瘤内蓄积并阻断CXCL12–CXCR4轴多重协同。 

（10）GBM小鼠体内荧光成像

SeM@GL NPs+超声组肿瘤组织ecto-CRT表达为PBS组的20.5倍（图7b,c），p-TBK1与p-IRF3水平亦最高（图S50）；瘤内IFN-β含量分别较PBS、MNP、SeNPs+US、SeM NPs+US、Se@GL NPs+US及SeM@GL NP组提高5.27、2.02、4.33、1.21、3.85与1.87倍（图7d）。TDLN中成熟DC（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）占比42.4%，高于其余六组（18.0–30.7%）（图7e,f）；瘤内CD8⁺T细胞浸润量增加1.36–3.79倍（图7g,h）。CXCR4靶向制剂（Se@GL NPs+US或SeM@GL NPs+US）显著降低MDSC（CD11b⁺Ly6G^low/^high Ly6C⁺）浸润，SeM@GL NPs+US组降至7.7%（图7i,j）；Tregs频率下降3.87–8.13倍（图7k,l）。脾内CD8⁺效应记忆T细胞（CD62L^lowCD44^high）比例达44.5%，显著高于对照（10.0–37.6%）（图7m,n）。

图7.体内免疫应答。（a）机制示意；（b-c）CLSM（50μm）及定量：SeM@GL+US组CRT暴露最高；（d）ELISA：血清IFN-β显著升高；（e-f）流式：瘤内成熟DC（CD11c+CD80+CD86+）比例最大；（g-h）流式：CD3+CD8+T细胞浸润最多；（i-j）流式：MDSC（CD11b+Ly6G^lo Ly6C^hi）最低；（k-l）流式：Treg（CD4+Foxp3+）最少；（m-n）流式：脾效应记忆T（CD3+CD8+CD62L^lo CD44^hi）最高

（11）术后抗GBM复发效应

GL261-Luc正位模型第10天行肿瘤切除术，H&E证实周边残留灶（图8a–c）。术后随机分为PBS、SeM NPs+US、SeM@GL NPs+US三组，尾静脉注射12 h后超声照射（1.0 W cm⁻²，1 MHz，40%占空比），每4天IVIS监测。PBS组荧光随复发递增；SeM NPs+US组先升后降；SeM@GL NPs+US组5只中1只无信号、4只仅微弱信号（图8d,e）。生存曲线显示SeM@GL NPs+US组40 d存活率显著高于PBS组（图8f），Ki67证实增殖抑制。流式检测示该组脑与脾IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞增多，脾CD8⁺TEM（CD62L^lowCD44^high）占比26.1%，为PBS的3.37倍、SeM NPs+US的1.81倍（图8g–j）。重复给药15 d后主要器官H&E未见异常，提示SeM@GL NPs体内安全性良好。

图8.术后抗GBM复发效应。a）术后治疗实验方案的示意图。b）肿瘤接种后第10天对GL261携带肿瘤小鼠进行肿瘤切除手术。c）手术切除肿瘤后GBM小鼠脑切片的代表性H&E染色图像。肿瘤切除腔内可见残留胶质瘤焦点，表明切除不完全。d）体内生物发光图像，e）测量小鼠手术干预及特定治疗后胶质瘤信号强度（n=5）。f）不同处理组小鼠的存活曲线（每组n=8只）。g）流式细胞术分析，h）不同治疗后肿瘤中CD3+CD8+IFNγ+T细胞群的相应定量分析（n=3）。i）流式细胞术分析，j）对不同处理后脾脏中CD3+CD8+CD62L低CD44高T的EM细胞群体进行相应定量分析（n=3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计显著性采用双尾学生t检验（e、f）和单因子方差分析（h、j）进行分析