针对上述问题，南方医科大学的曾春/谢登辉团队通过一锅法室温合成金属-多酚纳米花颗粒（Mg-PC），并将其负载于多巴胺修饰透明质酸（Dop-HA）与F127构成的双组分水凝胶中，构建了一种可注射、温敏且可塑的复合修复系统，以适配肌腱不规则缺损形态。Mg-PC不仅作为PC与镁离子的缓释载体，更作为化学交联剂显著提升水凝胶的机械强度与界面黏附性能。研究系统表征了水凝胶的稳定性、溶胀、压缩与流变学特性，并在体外证实其通过PC释放发挥抗炎抗氧化作用，调控巨噬细胞向M2型极化以改善修复微环境；同时，缓释的镁离子经TRPM7通道进入细胞，上调缺氧诱导因子-1α（Hif-1α）表达，进而促进软骨基质生成及干细胞的迁移、黏附、增殖与分化。该复合水凝胶实现了材料力学性能与生物活性因子时空释放的有机整合，为肌腱-骨界面损伤修复提供了兼具力学支撑与免疫调控功能的新型递送策略。该文章于2024年2月28日以《Controlled-release hydrogel loaded with magnesium-based nanoflowers synergize immunomodulation and cartilage regeneration in tendon-bone healing 》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.02.024）。 

研究示意图

（1）Mg-PC的合成与表征

在反应器加热条件下，配位过程加速形成Mg-PC（图1A）。XRD谱图显示Mg²⁺特征峰，表明其已整合入Mg-PC结构（图1B）。FTIR在1479 cm⁻¹和1285 cm⁻¹处出现芳香环与酚羟基特征吸收峰，该峰未在MgCl₂谱图中出现，证实PC已掺入（图1C）。TGA表明Mg-PC在升温至1000°C时质量损失约80%，有机/无机质量比约为1:4（图1D）。SEM显示Mg-PC纳米颗粒呈现300–500 nm的"纳米花"结构（图1E）。DLS测得粒径范围为200–600 nm（图1F）。元素映射图像进一步证实PC的掺入及Mg²⁺的均匀分布（图1G）。

图1 Mg-PC合成与表征。A）通过热液法进行Mg-PC的示意合成;  B）PC和Mg-PC的XRD谱图; C）MgCl的傅叶红外（FTIR）光谱2、PC，以及Mg-PC;  D）Mg-PC的TGA曲线; E）扫描电子显微镜图像和放大成像的Mg-PC图像; Mg-PC的粒径分布; G）Mg-PC的元素映射

（2）Mg-PC@Dop-HA/F127的合成与表征

多巴胺经EDC/NHS缩合接枝到透明质酸，FTIR在1680 cm⁻¹、1516 cm⁻¹出现酰胺峰（图S1A）；¹H NMR 6.7 ppm、2.76 ppm处新峰对应苯环及邻近儿茶酚的-CH₂（图S1B）；UV-Vis测得接枝率6.88%（图S2）。固定Dop-HA/F127，Mg-PC质量分数0–20%，体系依靠Dop-HA π-π堆积、F127氢键及Mg-PC与F127氢键交联；随Mg-PC升高，溶胶-凝胶转变温度与时间同步下降（图2B），10% Mg-PC@Dop-HA/F127为后续代表。FTIR证实产物结构（图2C）；样品4 °C与25 °C可流动，37 °C原位成胶（图2D），并具可注射、温敏及形状适配特性（图2E，Video S1–S3）。SEM给出微观形貌，元素分布与含量见图S3与表S1。溶胀率随Mg-PC、F127引入而降低（图S4）。流变频率与温度扫描表明1–100 rad/s内G′、G″平稳，F127模量最低，Mg-PC提升刚度（图2G，图S5）；1000%阶跃应变下G′由2600 Pa降至470 Pa，1%恢复后模量回弹，显示自愈合能力（图2H）；对肌腱与骨组织的粘附及自愈验证见补充图S6。拉伸强度：纯Dop-HA≈0.1 N，10% Mg-PC增强，20%因无机相过量下降（图2I）。PBS中35 d质量损失50–60%，Mg-PC延缓降解（图2J）；Mg²⁺与PC释放曲线表明20%组初期突释高，其余两组15 d后进入缓释平台（图2K），证实复合水凝胶可同步持续释放镁离子与原花青素。

图2 Mg-PC@Dop-HA/F127的合成与表征。 A）注射复合水凝胶机制示意图; B）不同Mg-PC含量复合水凝胶的凝胶特性; C）Mg-PC、Dop-HA、F127和10% Mg– PC@Dop-HA/F127的FTIR光谱; D）不同温度下的水凝胶巨观照片;  E）可注射性、热敏感性和形状适应性;F）扫描电子显微镜图像，含有不同Mg-PC含量的复合水凝胶; G）不同Mg-PC含量的复合水凝胶的弹性模量（G′）和粘度模量（G“）以及流变恢复行为（H）;I）不同Mg-PC含量的复合水凝胶的机械性能; J）不同Mg-PC含量的复合水凝胶的重量损失;以及Mg的释放特性2⁺（K）和PC（L）中含有不同含量的Mg-PC

（3）细胞的存活性、增殖与体外迁移

流式细胞术检测原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）标志物，CD29/CD90阳性率>90%，CD34/CD45阳性率<5%（图S7A、B），细胞呈纺锤形（图S7C），可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞（图S7D–F）。CCK-8显示降解产物稀释100倍时，10% Mg-PC@Dop-HA/F127组细胞活力达150%；稀释10倍时活力提升，1倍时各组活力为50–60%（图3A）。活/死染色证实其细胞相容性（图3B），10%组用于后续实验。Transwell和划痕实验显示，MgPC@DopHA/F127组纵向及24 h横向迁移率（约60%）均显著高于对照组（约30%）（图3C–G）。qPCR检测CCL2和CCL3表达验证其促迁移作用（图3H、I），表明该水凝胶可促进细胞增殖与迁移，利于腱-骨愈合。

图3 细胞的存活性、增殖与体外迁移。A）复合水凝胶降解产物的细胞毒性，Mg-PC含量不同在BMSCs上; B）用不同复合水凝胶的100倍降解产物处理的BMSCs活/死影像;  C）透孔测定的示意图;  D）不同复合水凝胶的Transwell图像和迁移率定量（F）;  E）细胞迁移图像及从零实验获得的相关定量数据（G）; H）和I）是用不同水凝胶降解产物处理后3天，BMSCS的CCL2和CCL3 mRNA表达的qRT-PCR结果

（4）体外抗氧化活性表现   

肩袖损伤引发炎症反应及局部ROS生成，阻碍腱-骨界面再生。DPPH法与细胞内ROS检测评估Mg-PC及Mg-PC@Dop-HA/F127抗氧化能力：DPPH自由基溶液呈紫色，随Mg-PC作用时间延长发生颜色变化（图4A、B）；10分钟后517 nm处吸收强度较对照组下降约38%（图4C、D），60分钟时清除率达约60%（图4E、F）。细胞内ROS检测显示Dop-HA/F127组与对照组相近，Rosup组升高，Mg-PC@Dop-HA/F127组显著降低（图4H），荧光强度降低约40%（图4G）。表明Mg-PC可有效清除ROS，为腱-骨界面再生提供有利微环境。

图4 Mg-PC和Mg-PC@Dop-HA/F127的抗氧化活性。A）DPPH自由基还原反应的示意图;B）DPPH溶液MgCl的照片2-处理过的DPPH溶液，以及不同时间的Mg-PC处理DPPH溶液;C）不同处理模式的紫外可见光谱;D）DPPH扫除率（n=3）;E）Mg-PC处理DPPH溶液在不同时间内的紫外可见光谱变化;F）Mg-PC的紫外-可见曲线;H）荧光图像，G）通过ROS测试套件获得BMSCs氧化抑制的相对荧光强度（n=3）

（5）体外免疫调节活性表现  

采用F4/80标记巨噬细胞，以iNOS和CD206分别标记M1和M2型。免疫荧光显示Mg-PC@Dop-HA/F127组iNOS荧光显著弱于其他组（图5B、D），CD206荧光强于其他组（图S8），表明镁离子促进M2型分化（图5C、E）。Western blot（图5F）及相对蛋白表达水平（图S9）证实该水凝胶显著降低iNOS表达并促进CD206表达，诱导巨噬细胞从M0向M2极化。流式细胞术分析RAW264.7细胞表面标志物显示，Mg-PC@Dop-HA/F127组CD86阳性细胞比例从LPS对照组42.1%和Dop-HA/F127组40.2%降至19.1%（图5G）。qPCR结果显示，该组iNOS和TNF-α（M1型）基因表达较对照组显著降低，而CD206和Arg（M2型）基因表达显著增加（图5H）。表明MgPC@DopHA/F127可有效调控巨噬细胞极化，促进其向M2型转化。

图5 复合水凝胶的免疫调节活性。A）研究水凝胶对M0巨噬细胞极化效应的实验示意图; B）和C）在水凝胶降解产物诱导M0巨噬细胞后，对iNOS和CD206进行免疫荧光染色; D）和E）iNOS和CD206的免疫荧光染色定量; F）西方印迹显示iNOS、CD206和GAPDH的表达。G）通过流式细胞术分析的RAW264.7表面标记（CD86和CD206）代表性图像。H） 在水凝胶降解产物诱导M0巨噬细胞3天后，对iNOS、TNF-α、CD206和Arg基因表达进行RT-qPCR测量

（6）体外骨生成分化表现  

成骨培养基中加入 100 倍稀释的 Mg-PC@Dop-HA/F127 降解产物后，第 14 天 BMSCs 的 ALP 表达显著升高（图 6A、B）；第 21 天茜素红染色图像及红色区域定量分析显示，Mg²⁺显著增强成骨分化 BMSCs 的矿化水平（图 6A、C）。Mg-PC@Dop-HA/F127 与 BMSCs 共培养 7 天，骨钙素（OCN）和 Runx2 的荧光强度显著高于对照组及 Dop-HA/F127 组，分别达到 4 倍和 6 倍（图 4C–E）。100 倍稀释的水凝胶降解产物在成骨培养基中培养 7 天后，Western blot 结果显示 Mg-PC@Dop-HA/F127 显著促进 Col I、ALP、Runx2 的蛋白表达（图 6D、图 S10A）；qPCR 结果显示其可诱导 Osx、ALP、Runx2 等成骨相关基因表达（图 S10B），验证了镁基生物材料的成骨分化促进作用。

图6 复合水凝胶促成骨与成软骨分化机制。A）ALP与茜素红染色图像；B）第14天ALP活性定量；C）第21天茜素红红色区域定量；D）成骨降解产物刺激BMSCs后Col I、ALP、Runx2 Western blot；E）成骨降解产物处理BMSC微球甲苯胺蓝染色；F）成软骨降解产物刺激BMSCs后Acan、Col II、Sox9 Western blot；G、H）成软骨降解产物处理7 d后Sox9、Col II RT-qPCR；I）成软骨降解产物联合Mg²⁺通道抑制剂2APB处理BMSC微球甲苯胺蓝染色；J）同条件下Col II与Aggrecan免疫荧光及荧光强度统计（N）；K）流式检测Mg²⁺代表图；L）Mg²⁺免疫荧光及定量（M）；O）成软骨降解产物联合2APB处理7 d后TRPM7、Hif-1α、Acan、Col II、Sox9 Western blot；P）同条件下Sox9、Col II、Aggrecan RT-qPCR

（7）体外软骨分化表现  

软骨诱导培养基联合水凝胶降解产物处理BMSC微团21 d，甲苯胺蓝染色（图6E）及第14天软骨标志蛋白Acan、Col II、Sox9 Western blot（图6F）显示，MgPC@Dop-HA/F127组软骨分化水平最高，其Sox9、Acan、Col II基因表达亦同步上调（图6G–H）。Trpm7通道介导的Mg²⁺内流激活Hif-1α为该过程关键：2APB阻断后，甲苯胺蓝染色（图6I）显示软骨细胞数量回降至对照水平；流式检测Mg²⁺阳性率由32.9%降至14.6%（图6K），免疫荧光Mg²⁺信号同步减弱（图6L–M）。Col II与Acan免疫荧光（图6J，N）定量表明，MgPC@Dop-HA/F127组荧光强度最高，2APB加入后显著下降。共培养7 d，RT-qPCR（图6P）测得MgPC@Dop-HA/F127组Sox9、Acan、Col II分别较对照上调2.24、1.93、1.49倍，2APB组表达低于对照；Western blot（图6O，S11）进一步证实MgPC@Dop-HA/F127组Acan、Sox9、Col II、Trpm7及Hif-1α蛋白同步升高，2APB阻断后全部回落。

（8）大鼠肩袖撕裂的体内研究（RCT）模型   

术后4周和8周取材行Micro-CT分析。图7B（3D可视化及冠状位图像）显示Mg-PC@Dop-HA/F127组修复界面形态优于其他组，8周时接近正常组。图7E与S12统计结果表明，该组骨密度、骨体积分数、骨小梁数量及厚度均高于其他组，骨小梁分离度最低；缝合组各参数值均为最低。基于CT数据重建肩关节有限元模型，施加200 N张力载荷模拟肌腱行为（图7C），冈上肌腱-肱骨头交界处最大应力在8周时分别为：正常组969.4 MPa、缝合组2608.8 MPa、Dop-HA/F127组1625 MPa、Mg-PC@Dop-HA/F127组1002 MPa，提示后者应力分布接近正常组。生物力学测试（图7D、F）显示，Mg-PC@Dop-HA/F127组在4周和8周的最大载荷与刚度值均高于其他组，且该组在最大载荷点与正常组无显著差异，而DopHA/F127组与单纯缝合组无统计学差异。

图7 微型CT分析结果及体内动物实验生物力学测试数据。A）动物实验示意图;B）手术后4周和8周大鼠近端肱骨微型CT的三维重建图像和冠状图像;C）大鼠手术后4周和8周时，近端肱骨有限元模型图像;D）生物力学测试图像;E）肌腱与骨头接口的BMD、BV/TV和Tb. Sp值;F）生物力学测试数据，包括最大载荷、刚度和最大载荷下的距离

术后4周及8周组织学分析结果如图8所示。4周时各组肌腱愈合均不完全，但Mg-PC@Dop-HA/F127组炎症细胞浸润较少且肌腱组织排列更规则。8周时该组胶原纤维排列更有序（图8A），肌腱成熟度评分显著高于缝合组与Dop-HA/F127组（P<0.05，图8D）。甲苯胺蓝染色显示，8周时Mg-PC@Dop-HA/F127组纤维软骨面积显著大于缝合组及Dop-HA/F127组（图8B、D）。天狼星红偏振光染色表明，Mg-PC@Dop-HA/F127组纤维组织沉积增加，8周后胶原组织改善明显并接近正常组（图8C）。

图8 处理后新形成的腱骨界面组织的形态学分析。A）采用正常、缝合组Dop-HA/F127和Mg-PC@Dop-HA/F127组处理大鼠切片的代表性图像，显示血液素和伊欧氨酸染色（H&E）及甲苯胺蓝/快绿染色（B）。T：腱;I：界面;B：骨骼。C）不同处理组的Sirius红染色照片;D）不同处理组的骨肌腱界面成熟评分（n=3）以及E）不同处理组新形成纤维软骨区域（n=3）

为阐明MgPC@DopHA/F127水凝胶修复腱骨界面的机制，行免疫组织化学染色（图9）。4周时Mg-PC@Dop-HA/F127组Trpm7与Hif-1α表达（168.6±8.2%和174.5±8.8%）显著高于缝合组（97.8±5.5%和81.6±6.3%）、DopHA/F127组（86.9±4.5%和94.9±4.2%）及正常组，8周时趋势相同。Col II与Sox9表达在4周时Mg-PC@Dop-HA/F127组（195.1±8.0%和198.3±9.8%）显著高于其余三组，8周时虽降至140.0±10.7%和124.4±8.4%但仍高于单纯缝合组。结果表明水凝胶可稳定释放Mg²⁺，维持细胞内高镁环境，上调Trpm7表达，促进Hif-1α表达，加速软骨生成。

图9 治疗后新形成的腱骨界面组织的免疫组化染色。A）不同处理组（n=3）在治疗后4周和8周（B&C）中，Trpm7和Hif-1α在腱骨界面的免疫组化染色图像及相关表达水平（n=3）。D）不同处理组（n=3）在治疗后4周和8周（E&F）中，免疫组化染色图像及Col II和Sox9在腱骨界面的相关表达水平

免疫荧光检测干细胞迁移标志物CD44与M2型巨噬细胞标志物CD206（图10）。4周及8周时MgPC@DopHA/F127组CD44阳性细胞数（299.8±20.4%和326.6±24.6%）显著高于其余三组。4周时Mg-PC@Dop-HA/F127组CD206阳性细胞数（188.3±7.1%）亦显著高于其他组，提示原花青素与Mg²⁺协同释放可更有效诱导M2型巨噬细胞分化，减轻炎症并加速组织再生。

图10 免疫荧光（CD44和CD206）染色结果。A）不同组别治疗后4周和8周时，肌腱骨界面的免疫荧光及相对强度定量（C）;B）不同组间治疗后4周肌腱骨界面的CD206免疫荧光及相对强度定量（D）治疗后4周，不同组中肌腱-骨界面处CD206的表达