针对上述问题，上海大学苏佳灿教授、张琴副研究员和周东阳团队联合苏州大学郑厚峰教授团队合作设计并构建了一种智能化的酶响应型DNA-PEG水凝胶，通过整合VEGF-结合 DNA 结构、MMP-可切肽交联结构及 RGD 黏附序列，实现对血管生成、成骨及矿化过程的序贯激活与协同调控。水凝胶在体内受 MMP 刺激逐步降解，首先释放 VEGF 促进血管生成，继而通过内皮细胞的旁分泌作用激活 BMSC 的 MAPK-介导成骨分化；随后，随着核酸框架被核酸酶降解产生磷酸根，与内源性 Ca²⁺协同诱导 CaP 成核与矿化。该系统通过微环境自适应的时序性机制整合血管-骨-矿化三重过程，大幅提升骨修复效率，并通过分子动力学模拟验证了 CaP 在水凝胶肽基底上的靶向成核行为。本研究提出了一种可主动调控骨微环境的动态水凝胶设计策略，为复杂骨缺损治疗提供了新的思路与技术平台。该文章于2025年11月2日以《Enzyme-Programmable DNA-PEG Hydrogel Spatiotemporally Regulates Bone Regeneration Microenvironment》为题发表于《Advanced Materials》上（DOI：10.1002/adma.202514461）。

图1. 酶响应DNA-PEG水凝胶的构建与机制。（A）水凝胶的设计示意图，展示MMP可切肽交联的PEG网络与VEGF结合DNA链的共价组装；（B）水凝胶的动态调控机制示意图，包括MMP介导的降解与细胞渗入、VEGF持续释放促进血管生成和成骨分化、以及核酸酶降解DNA后释放磷酸根与肽段和内源Ca²⁺协同诱导矿化，从而实现血管生成-成骨-矿化的时序协同调控以促进骨再生

（1）酶响应型DNA-PEG水凝胶的合成与表征

该研究构建了基于硫醇-降冰片烯光交联的酶响应DNA-PEG水凝胶体系（图1A），其中8-臂PEG-NB的成功修饰经¹H-NMR确认（图2A），FTIR进一步验证了酰胺键的形成。水凝胶在UV照射下迅速完成凝胶化（图2B、2C），并保持良好的可注射性与可塑性（图2D）。共聚焦成像显示PAV凝胶实现了均一的DNA分布（图2E）。所有凝胶均具有约15 μm的多孔结构（图2F、2G），PAV凝胶中检测到特征性元素P（图2H），且各组凝胶的杨氏模量保持一致（约30 kPa，图2I、2J）。不同配方凝胶的润湿性相近（图3A），在PBS中21天溶胀稳定（图3B）。在胶原酶作用下，凝胶呈剂量依赖性降解，在0.1 U/mL条件下7天基本完全降解（图3C）。分子对接与能量计算显示VEGF与DNA链具有稳定且特异的结合（图3D、3E）。相应地，PAV凝胶呈现缓慢且持续的VEGF释放，21天释放约75%，而PV凝胶15天已超过90%（图3F）。DNA条带保持完整（图3G），PA凝胶出现260 nm特征吸收峰（图3H），证实DNA成功负载。外切酶作用下，含肌动蛋白的PA凝胶在1天释放极低的磷酸根，而不含肌动蛋白的组释放明显升高（图3I），表明肌动蛋白可延缓DNA降解并实现后期矿化阶段的磷酸根供应。

图2. 水凝胶的表征。（A）¹H-NMR用于确认PEG前体结构；（B）流变测试显示紫外照射触发的凝胶化行为；（C）紫外照射下的溶胶-凝胶转变；（D）凝胶的可注射性与可塑性展示；（E）共聚焦图像显示DNA在凝胶中的分布；（F）冷冻-SEM揭示凝胶微观结构；（G）孔径定量分析（n=15）；（H）EDS元素分布图；（I）凝胶杨氏模量的3D映射；（J）杨氏模量分析（n=20，差异以ns标注）

图3. 水凝胶的酶响应降解与释放行为。（A）不同凝胶的接触角图；（B）凝胶在PBS中21天的溶胀行为（n=3）；（C）凝胶在PBS及不同浓度胶原酶I中的体外酶降解情况（n=3）；（D）VEGF与凝胶内DNA链结合的对接示意；（E）DNA与VEGF的相互作用能分析；（F）PV与PAV凝胶的VEGF累积释放曲线（n=3）；（G）DNA链的琼脂糖凝胶电泳；（H）P与PA凝胶的UV–vis光谱；（I）外切酶T作用1天后的磷酸根释放量（n=3，差异以ns和***p < 0.001标注）

（2）水凝胶介导矿化的分子动力学模拟

分子动力学模拟表明，100 ns 内水凝胶体系中PO₄³⁻、Ca²⁺与肽段逐步聚集，PO₄³⁻与肽段在20 ns 即显著富集，50 ns 出现Ca²⁺密度增加，最终在100 ns 形成明显共定位，呈现先PO₄³⁻-肽段组装、后Ca²⁺参与的双阶段矿化过程（图4A）。分子构型显示20 ns 时PO₄³⁻已与肽段结合，而Ca²⁺在100 ns 稳定结合PO₄³⁻形成磷酸钙前体（图4B、4C）。RDF分析显示PO₄³⁻与肽段之间的相互作用强于PO₄³⁻与Ca²⁺，支持由肽段先行组织PO₄³⁻、再吸引Ca²⁺的序贯矿化机制（图4D）。体系RMSD在约80 ns 后趋于稳定（图4E），Rg逐渐下降（图4F）、SASA显著降低（图4G），提示体系随聚集过程向更紧凑结构转变。体外矿化实验中，肽段与DNA在SBF中生成的沉淀经TEM证实为磷酸钙（图4H），EDS检测到Ca与P元素（图4I），SAED显示产物为无定形结构，验证了模拟预测的“DNA来源PO₄³⁻先组织肽段、再吸引Ca²⁺形成磷酸钙”的矿化机制，体现出PAV水凝胶在VEGF递送之外还具备酶响应矿化模板功能。

图4. 水凝胶介导的矿化模拟与实验表征。（A）100 ns范围内PO₄³⁻、Ca²⁺与肽段的分子动力学快照及密度热图；（B）矿化相关分子对接作用示意；（C）矿化关键组分的分子构型；（D）20 ns时PO₄³⁻–肽段及100 ns时PO₄³⁻–Ca²⁺的RDF分析；（E）体系的RMSD曲线；（F）体系的Rg曲线；（G）体系的另一RMSD评估；（H）凝胶介导形成的磷酸钙TEM图；（I）肽段与DNA产物在SBF孵育后的EDS元素分布图

（3）体外生物相容性和水凝胶介导的血管生成

水凝胶在BMSCs与HUVECs中表现出良好体外生物相容性，活/死染色显示各组死亡细胞极少（图5A、5B），CCK-8检测表明两类细胞在5天内持续增殖，其中PAV凝胶在第5天显著促进HUVEC增殖（图5C、5D），并与细胞计数结果一致，呈现PV与PAV凝胶优于其他组的趋势。细胞骨架染色显示BMSCs在凝胶表面呈延展形态，HUVECs保持铺路石状形态，PAV凝胶表面的细胞黏附与铺展最为明显（图5E）。共培养条件下，PAV凝胶显著上调HUVEC血管生成相关基因，VEGF、ANG与CD31表达分别提高约3.8、2.1与3.9倍（图5F）。管腔形成实验显示PV与PAV凝胶均可促进毛细血管样结构形成，其中PAV凝胶形成的分支节点可达1.9×10³，总管长约2.0×10³ µm，分别较对照组提升约15.1倍与9.0倍（图5G、5H），说明通过DNA链介导的VEGF持续释放显著增强了促血管生成能力。

图5. 水凝胶的体外生物相容性与促血管生成性能。（A）BMSCs与（B）HUVECs的活/死染色；（C）BMSC与（D）HUVEC的CCK-8增殖评估（n=5）；（E）BMSCs与HUVECs在凝胶表面的F-actin染色；（F）HUVECs在凝胶共培养下的血管生成相关基因表达（n=3）；（G）血管生成管形成的示意及代表性图像；（H）管形成定量分析（n=3，差异以ns、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001标注）

（4）体外成骨效果

Transwell共培养系统显示PV与PAV凝胶可增强BMSC成骨分化（图6A）。第7天ALP染色中，PAV组呈现最强早期成骨活性，ALP活性较对照组提高约3.1倍（图6B、6C）。第14天ARS染色显示PV及PAV凝胶显著促进钙沉积，其中PAV组矿化程度较对照组提升约3.0倍（图6D、6E）。qPCR结果进一步证实PAV凝胶显著上调多种成骨相关基因，Runx2、Col1a1、Bmp-2、Alp与Opn分别提高约2.8、4.2、6.0、6.1与4.2倍（图6F），表明其可同时增强早期成骨信号与基质成熟过程。

图6. 水凝胶的体外成骨促进作用。（A）BMSC成骨分化的Transwell共培养示意图；（B）ALP染色与（D）ARS染色的代表性图像；（C）ALP及（E）ARS染色的定量分析（n=3）；（F）BMSC成骨相关基因表达（n=3，差异以ns、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001标注）

（5）体内骨再生及其机制

在大鼠5 mm颅骨缺损模型中，水凝胶经原位光交联后植入，12 周内用于评估体内成骨与血管再生（图7A、7B）。Micro-CT显示对照组与P Gel组成骨极少，而PAV Gel在12周实现明显缺损桥接并形成致密新骨（图7C）。定量分析显示PAV Gel的BV/TV达45.8±6.4%，显著高于PV（26.2±3.1%）、PA（18.4±1.3%）、P（14.5±0.8%）及对照组（10.2±0.4%）（图7D），并呈现最高Tb.N（1.5±0.1 mm⁻¹）和BMD（0.4±0.1 g cm⁻³）（图7E、7F）。PA组BV/TV与Tb.N高于P组，与DNA酶解释放PO₄³⁻促进成骨相关。激光散斑成像显示PAV Gel在2周即显著增强局部血流，并在12周保持最高灌注水平（图7G），与后续6周与12周的增强成骨活动呈时序耦合，表明早期血管生成与后期成骨-矿化存在紧密关联。水凝胶中肽段预组织PO₄³⁻并吸引Ca²⁺的模拟机制与体内矿化结果一致，PAV Gel通过DNA提供PO₄³⁻并富集内源Ca²⁺促进局部CaP形成。荧光成像显示所有水凝胶在体内均呈逐渐降解趋势，各组降解速率一致，且在10周后仍可检测（图7H、7I），说明统一的PEG-NB骨架与MMP-敏感肽交联方式带来稳定且可控的酶降解行为。综合来看，PAV水凝胶通过可编程的时序释放与MMP响应降解，实现对血管生成、成骨及矿化的同步调控，显著加速骨再生，优于传统依赖被动释放的系统。

图7. 水凝胶在大鼠颅骨缺损模型中的骨再生效果。（A）体内实验时间线示意；（B）水凝胶植入后的骨再生示意图；（C）6与12周的Micro-CT图像；（D–F）BV/TV、Tb.N及BMD的定量分析（n=3）；（G）12周缺损区域的激光散斑血流成像；（H）体内水凝胶降解情况；（I）水凝胶体内降解的定量分析（n=3，差异以ns、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001标注）

组织学与免疫染色结果进一步证实了体内成骨效果：H&E显示对照组缺损区域以纤维组织填充，成骨不足，而PV与PAV组在12周均形成明显骨痂，其中PAV组呈现最完整的板层骨结构（图8A）。Masson染色显示PAV组胶原沉积最丰富且排列致密，提示更成熟的细胞外基质形成（图8B）。免疫组化结果显示成骨早期与晚期标志物BMP-2与OCN在PAV组表达最高（图8C、8D），与其强化成骨与矿化过程一致。免疫荧光染色显示PAV组在12周呈现更高水平的CD31与α-SMA（图8E、8F），表明血管生成增强并形成更成熟的血管网络。半定量分析进一步确认PAV组BMP-2、OCN、CD31和α-SMA显著上调，说明血管生成的增强与成骨加速相互耦合。

图8. 水凝胶促进骨再生的组织学与免疫染色评估。（A）骨组织的H&E染色及（B）Masson染色；（C）BMP-2与（D）OCN的免疫组化染色；（E）CD31与（F）α-SMA的免疫荧光染色

转录组测序在植入后2周的新生骨组织中检测到296个上调基因和74个下调基因（图9A）。PAV组中多种促血管生成基因（Pdgfb、Angptl、Vegfa）与成骨相关基因（Runx2、Alp、Col1）显著上调（图9B）。GO分析显示差异基因富集于骨矿化、骨重塑与血管发育等过程（图9C），KEGG分析进一步揭示VEGF、TCA循环、MAPK等与血管生成和成骨密切相关的信号通路显著富集（图9D），表明PAV水凝胶可调控局部微环境以加速骨再生。

图9. 新生骨组织的RNA-seq分析。（A）PAV凝胶组与对照组的差异基因火山图；（B）血管生成与成骨相关基因的表达热图；（C）GO富集分析；（D）KEGG通路富集分析