针对上述问题，温州医科大学罗丽华、王周光、徐俊鹏和蔡晓军团队提出了一种创新的无细胞治疗策略：他们将人脱落乳牙干细胞（SHEDs）裂解物（CL） 封装于纤维蛋白原/凝血酶（FT）水凝胶中，构建出具有抗炎与促血管生成双重功能的FT/CL智能水凝胶系统。该文章于2025年07月28日以《A cell-free SHED lysate-hydrogel system for oral ulcer healing with anti-inflammatory and pro-angiogenic effects》为题发表于《Journal of Nanobiotechnology》（DOI: 10.1186/s12951-025-03597-3）。

图1 研究示意图

（1）SHEDs和CL的成功培养与表征

成功从人脱落乳牙牙髓中分离出SHEDs，细胞表现出典型的MSC特性：免疫荧光染色CD146和Stro-1呈阳性；图2A-C: 显示原代SHEDs生长良好，表达MSC标志物（CD146/Stro-1），并具有成骨、成脂、成软骨分化能力。具备成骨、成脂、成软骨的多向分化潜能；通过反复冻融法成功制备SHEDs来源的CL；考马斯亮蓝染色证实CL的蛋白质谱与原始SHEDs高度相似。图2D: 考马斯亮蓝染色证明CL的蛋白成分与原始SHEDs相似。CCK-8和活/死细胞染色表明CL无细胞毒性，且最佳浓度（150 μg/mL）能促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖。图2E-G: CCK-8和活/死染色表明CL无细胞毒性，且150 μg/mL浓度能最佳促进HUVECs增殖。

图2 SHED和CL的培养和表征。A SHED的原代培养。B MSC标记CD146和Stro-1的免疫荧光染色。C SHED的成骨、成脂和软骨发育分化。D相同数量细胞的SHED和CL考马斯蓝染色。E不同CL剂量下HUVECs细胞增殖情况F钙黄素-AM（绿色）和PI（红色）染色不同CL浓度下HUVECs G各组平均活细胞数F在所有实验中，n=3个生物重复的数据均以平均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001

（2）FT/CL水凝胶的优化与性能表征

SEM图像显示图3A:水凝胶具有均匀多孔结构。图3B-C: 降解和释放曲线表明FT (1:1.5) 水凝胶能持续降解并控制CL释放超过60小时。图3D-F: 活/死染色和CCK-8证明水凝胶生物相容性好，且FT (1:1.5) 促进细胞增殖效果最佳。通过筛选不同纤维蛋白原与凝血酶比例，确定FT (1:1.5) 为最佳配方，兼具良好的凝胶时间、降解速率和生物相容性。该水凝胶具备：均匀的多孔三维结构。图3G-H: 水凝胶表现出良好的可注射性，且FITC标记显示其能在口腔溃疡面稳定粘附超过24小时。可控的CL释放能力（36小时释放超过60%），展示出优异的可注射性和强大的组织粘附性。

图3 FT水凝胶的表征。A FT水凝胶的SEM图像。B FT水凝胶在PBS中孵育的降解曲线。C 不同比例水凝胶中CL的累积释放。D 与FT水凝胶共培养的HUVECs的钙黄绿素-AM/PI染色图像和(E)通过Image J的定量。F 与FT水凝胶共培养的HUVECs的OD值。G FT水凝胶的可注射性和宏观凝胶化。H 通过监测荧光染料评估异硫氰酸荧光素（FITC）标记的FT水凝胶的滞留性。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD表示：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（3）FT/CL水凝胶在体外展现出抗炎与促血管生成双重功效

抗炎作用：在与巨噬细胞共培养实验中，FT/CL水凝胶能：在LPS诱导的M1模型中，显著抑制促炎因子iNOS和TNF-α的表达。图4A-H: 免疫荧光染色及定量显示，FT/CL能显著抑制LPS诱导的M1标志物（iNOS, TNF-α），并促进IL-4诱导的M2标志物（CD206, Arg1）表达。在IL-4诱导的M2模型中，显著促进抗炎因子CD206和Arg1的表达。图4I-K: 血管形成实验表明，FT/CL处理组的管状网络更复杂，管腔长度和数量显著高于对照组。促血管生成作用：在血管形成实验中，与FT/CL水凝胶共培养的HUVECs：形成的管腔长度是对照组的2.5倍。形成的管状结构数量是对照组的3.7倍。

图4 FT/CL水凝胶在体外抑制炎症并促进血管生成。A iNOS, B TNF-α, C CD206 和 D Arg1（红色）以及CD68（绿色，巨噬细胞标志）在不同组中的免疫荧光染色。各组E iNOS, F TNF-α, G CD206 和 H  Arg1 表达的统计分析。I 8小时后HUVECs的血管形成图像。J 描绘管长度的半定量分析。K 描绘管数量的半定量分析。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（4）FT/CL水凝胶在大鼠口腔溃疡模型中加速愈合

宏观愈合：FT/CL治疗组溃疡面积缩小最快，在第3、5、7天均保持最小。图5B: 系列舌部照片显示FT/CL组溃疡愈合最快，第5天上皮几乎完全恢复。行为学改善：显著减少由疼痛引起的面部擦拭和口腔摩擦行为。图5C-F: 行为学分析表明FT/CL组能显著减少疼痛引起的面部擦拭和口腔摩擦次数。 促进体重恢复，表明全身状况改善。临床评分：宏观评分显示FT/CL组临床严重程度最低，无出血或脓肿。图5G-H: FT/CL组体重恢复最快，宏观临床评分最低。

图5 FT/CL水凝胶治疗组在伤口愈合和酸诱发口腔溃疡（OU）的行为评估方面显示出更好的改善。A 显示伤口产生和随后的愈合阶段的说明图。B 7 天内舌头的代表性图像。白线表示舌头上的特定伤口。C 说明图和第 1、2、3 天 3 分钟时间内擦拭面部的次数。 D Ctrl 组和 FT/CL 组之间的比较。E 说明图以及第 1、2 和 3 天 3 分钟块期间的口腔摩擦次数 (F)。*，Ctrl 组和 FT/CL 组之间的比较。G 与酸刺激后第 0 天相比体重的变化。H 宏观评分评估 OU 的临床严重程度。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（5）FT/CL水凝胶促进高质量的组织重塑

组织学显示：治疗第7天，FT/CL组表现出：最完整的再上皮化，上皮层更厚、结构更成熟。图6A-B: HE染色显示FT/CL组上皮最完整、血管最丰富（黑色箭头）。丰富的再生血管和成熟有序的胶原纤维沉积。图6C-D: Masson染色显示FT/CL组胶原排列有序且沉积量合理。细胞水平验证：Ki67阳性细胞数显著增加，表明细胞增殖活跃。TUNEL阳性细胞数显著减少，表明细胞凋亡被有效抑制。 图6E-H: Ki67和TUNEL染色表明FT/CL组细胞增殖最活跃，凋亡最少。

图6 FT/CL水凝胶在第7天修复OU大鼠舌组织的有效性。A 溃疡舌组织的HE染色。黑色箭头表示再生血管。B 溃疡舌组织的Masson染色。C 基底膜下血管的定量。D 胶原合成的定量分析。E 酸诱导溃疡组织中 Ki67 的代表性免疫荧光图像。F 各组Ki67表达量的统计分析。G 溃疡舌组织的 Tunel 染色。H 各组tunel阳性细胞的定量分析。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（6）FT/CL水凝胶在体内强力促进血管再生

治疗第7天，通过多种技术验证其促血管生成能力：图7A-D: 免疫荧光显示FT/CL组CD31和VEGF表达强度最高，表明新生血管密度最高。qPCR与WB：CD31和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达均显著上调。图7E-F: qPCR证实FT/CL组CD31和VEGF的mRNA水平最高。图7G-I: Western Blot进一步在蛋白水平验证了CD31和VEGF的上调。

图7 FT/CL治疗组在第7天显示出更好的血管再生促进作用。A 酸诱导溃疡组织中CD31的代表性免疫荧光图像和(B) VEGF的代表性免疫荧光图像。C 各组CD31表达量的统计分析和(D) VEGF表达量的统计分析。E 各组CD31的mRNA表达水平和(F) VEGF的mRNA表达水平。G 免疫印迹（WB）检测各组CD31和VEGF蛋白表达水平。H CD31 和 (I) VEGF 的平均蛋白表达水平。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（7）FT/CL水凝胶在体内有效调控炎症反应

治疗第3天（炎症高峰期）的组织分析显示：HE染色：FT/CL组炎症细胞浸润最少，基底膜再生最早。图8A: 第3天HE染色显示FT/CL组炎症浸润最轻，组织架构恢复最好。图8B: 免疫荧光显示FT/CL组iNOS/TNF-α信号最弱，而CD206/Arg1信号最强。免疫荧光与WB：促炎M1标志物（iNOS, TNF-α）表达最低，而抗炎M2标志物（CD206, Arg1）表达最高，证明其能有效将巨噬细胞从M1表型极化为M2表型，从而控制炎症。图8C-H: Western Blot定量证实FT/CL组显著抑制了M1蛋白表达，促进了M2蛋白表达。

图8 FT/CL治疗组在第3天表现出更好的炎症调节。A 溃疡舌组织的HE染色。B 酸诱导溃疡组织中 iNOS、TNF-α、CD206 和 Arg1 的代表性免疫荧光图像。C M1 标记物 iNOS 和 TNF-α 的蛋白质印迹分析。D M2 标记 CD206 和 Arg1 的蛋白质印迹分析。E iNOS 和 (F) TNF-α 的蛋白表达水平。G CD206 和 (H) Arg1 的蛋白表达水平。在所有实验中，数据均以 n = 3 次生物学重复的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001