针对上述问题，温州医科大学肖健团队开发一种可注射铁响应水凝胶TC@BS（单宁酸-壳聚糖负载BSA@Se），利用单宁酸螯合ex-iron降铁负荷，同时释放BSA@Se清除ROS，抑制铁死亡、恢复线粒体形态与功能；该体系可在DFU创面提供机械支撑并促进血管新生，从而加速糖尿病小鼠创面愈合，并揭示其通过调控铁死亡代谢通路增强内皮细胞活性的机制。该文章于2025年8月22日以《A multifunctional hydrogel promotes diabetic wound healing by remodeling iron balance and energy metabolism》为题发表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2025.123640)。

图1.高糖状态下TC@BS在内皮细胞铁代谢平衡和线粒体TCA循环中的作用示意图

（1）糖尿病创面铁过载和铁死亡水平升高

铁死亡是一种新型程序性细胞死亡形式，与多种病理状况相关。在糖尿病伤口愈合中，单细胞组学分析显示，来自愈合和未愈合糖尿病足溃疡的细胞被聚类成七个不同细胞群体（Fig. 2A）。内皮细胞在两组间表现出显著差异。GO富集分析揭示脂肪酸代谢、脂肪酸运输和脂质运输等关键生物过程在两组间显著改变（Fig. 2B）。拟时序分析表明，血管内皮细胞的发育轨迹与GPX4和VEGF的下调以及IL-6的上调相关（Fig. 2C和D）。细胞进展与铁死亡、血管生成和炎症有更强关联（Fig. 2E）。蛋白质印迹结果显示，在DM组中，FTH1和GPX4的表达显著低于对照组，而TFR1表达较高（Fig. 2F和G）。免疫组织化学染色显示，DM组伤口组织中GPX4和FTH1的阳性点显著较少（Fig. 2J–L和K-M）。免疫荧光染色显示，4-HNE的荧光强度在DM组较高（Fig. 2H和I）。普鲁士蓝染色表明，DM组伤口组织中的铁浓度显著增加（Fig. 2N和O-Q）。人样本的蛋白质印迹结果同样显示，DM患者伤口组织中FTH1和GPX4表达较低，而TFR1表达较高（Fig. 2R）。

图2 铁离子诱导糖尿病创面铁死亡的验证。（a）非糖尿病与糖尿病患者足部皮肤单细胞tSNE聚类图，细胞按类型着色；（b）内皮细胞GO富集分析；（c）内皮细胞伪时序发育轨迹；（d）随拟时序GPX4、VEGF下降而IL-6上升；（e）两组创面内皮细胞GPX4、FTH1、SLC7A11、IL6、VEGFA表达对比；（f–g）小鼠正常与糖尿病创面FTH1、TFR1、GPX4的WB结果；（h–i）小鼠创面4-HNE免疫荧光代表性图像及定量；（j–k）小鼠创面GPX4免疫组化代表性图像及定量；（l–m）小鼠创面FTH1免疫组化代表性图像及定量；（n–o）小鼠正常与糖尿病创面普鲁士蓝染色代表性图像及铁沉积定量；（p–q）患者正常与糖尿病创面普鲁士蓝染色代表性图像及铁沉积定量；（r）患者创面FTH1、TFR1、GPX4的WB结果。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（2）高糖和Fe³⁺诱导内皮细胞铁死亡和能量代谢障碍

在HG和Fe³⁺处理组中，ROS和脂质过氧化水平显著高于对照组（Fig. 3A, I, sFig. 1A, B）。细胞内Fe²⁺浓度在HG和Fe³⁺刺激下显著升高（Fig. 3B, J）。线粒体膜电位下降，表现为红荧光减少和绿荧光增加（Fig. 3C, K）。线粒体融合减少或分裂增加（Fig. 3E-F, L），且线粒体超微结构显示膜破碎、嵴缺失、紊乱和空泡化（Fig. 3D）。抗铁死亡蛋白GPX4表达在HG和Fe³⁺组下调（Fig. 3G-H, M）。蛋白质印迹分析表明，TFR1表达在Fe³⁺组显著高于HG组，DMT1表达在两组均高于对照组但无显著差异，而FPN表达在HG和Fe³⁺组下调（Fig. 3N）。HUVECs的迁移能力被HG和Fe³⁺抑制（Fig. 3O, P）。ATP水平下降，MDA水平上升（Fig. 3Q, R）。OCR显示呼吸能力相关参数降低（Fig. 3S）。

图3 铁离子诱导HUVEC铁死亡及能量代谢紊乱的体外验证。（a）CellROX代表性图像及定量；（b）FerroOrange代表性图像及定量；（c）JC-1检测线粒体膜电位代表性图像及定量；（d）TEM超微结构；（e-f）MitoTracker线粒体形态代表性图像及定量；（g-h）GPX4免疫荧光代表性图像及定量；（i）铁代谢相关蛋白FTH1、TFR1、FPN、DMT1的WB；（j-k）划痕实验代表性图像及迁移率定量；（l-m）ATP与MDA含量；（n）Cell Mito Stress Test检测OCR曲线。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns无显著性，n = 3

（3）TC@BS水凝胶的表征

根据管反转试验，TA与CC混合物在室温凝胶化后能稳定附着于管底，表明水凝胶形成（Fig. 4A）。SEM显示TC具有均匀的多孔结构，适合作为载体（Fig. 4B）。流变学实验证实水凝胶具备稳定的流变学性能和可注射性（Fig. 4C–F）。随着TC水凝胶中TA浓度增加，FeCl3溶液颜色由黄变为深绿，表明Fe³⁺被还原为Fe²⁺（Fig. 4G）。铁离子螯合能力检测显示TC对铁的螯合能力显著高于CC（Fig. 4H）。EDS分析确认BSA@Se纳米颗粒中S和Se元素均匀分布（Fig. 4I）。SEM显示BSA@Se呈圆形，粒径小于100 nm（Fig. 4J, K）。负载BSA@Se后TC水凝胶的形态与孔结构未发生显著改变，BSA@Se成功附着于孔隙表面（Fig. 4L）。在PBS环境中，TC@BS能良好粘附于心脏、肝、脾、肺及肾组织表面（Fig. 4M, sFig. 2A）。溶胀实验表明TC@BS在FeCl3中的溶胀率显著高于PBS环境（Fig. 4N）。释放实验显示TC@BS在FeCl3中的释放效果更优（Fig. 4O）。

图4 TC@BS的表征。（a）TA、CC与TC倒置实验；（b）CC与TC表面及截面SEM图；（c-d）CC与TC孔径分布；（e）TC水凝胶流变性能；（f）水凝胶可注射演示；（g）TC与不同浓度Fe³⁺溶液反应颜色变化；（h）CC与TC铁螯合能力；（i）BSA@Se的EDS元素分布；（j）BS的SEM图；（k）BS粒径；（l）TC@BS的SEM图及BS在TC中的分布；（m）TC@BS在PBS中粘附心、肝、脾、肾组织切片；（n）TC@BS在PBS与Fe³⁺溶液中的溶胀行为；（o）TC@BS在PBS与Fe³⁺溶液中BS的体外释放曲线

（4）TC@BS水凝胶的生物安全性和生物相容性

溶血试验显示TC、BS和TC@BS的溶血率与PBS组无显著差异，均低于5%，表明材料具有良好的生物相容性（Fig. 5A, B）。CCK-8和EdU染色实验证实Fe³⁺处理引发细胞毒性，而TC、BS和TC@BS处理能显著恢复细胞活力（sFig. 3A–C）。Calcein-AM/PI双染色结果显示TC@BS处理有效减少Fe³⁺诱导的细胞死亡（Fig. 5C, D）。纤维连接蛋白粘附实验表明Fe³⁺处理显著降低HUVECs粘附能力，TC@BS预处理可减轻该抑制作用（Fig. 5E, F）。管形成、迁移和划痕实验证明Fe³⁺暴露损害内皮细胞的管形成和迁移功能，TC@BS处理则恢复这些功能参数（Fig. 5G–L）。Western blot分析显示Fe³⁺处理导致VE-Cadherin、AAMP和VEGF-A表达下调，而TC@BS后处理能逆转这些分子变化（Fig. 5M, N）。

图5 TC@BS的生物相容性。（a）溶血率对比（PBS、TC、BS、TC@BS，Triton为阳性对照）；（b）Calcein/PI活死染色图像及定量；（c）细胞-基质黏附实验图像及定量；（d）成管实验图像及节点数定量；（e）Transwell迁移实验图像及计数；（f）划痕愈合实验图像及迁移率；（g）WB检测VE-Cadherin、AAMP、VEGF-A表达

（5）TC@BS体外抑制人脐静脉内皮细胞铁死亡水平

在高糖微环境中，将HUVECs与水凝胶共培养后进行分析。DCFA-DA染色显示，TC、DFO和TC@BS组的细胞ROS水平均显著低于Fe³⁺组，其中TC@BS组效果最为显著（Fig. 6C, H）。FerroOrange染色表明TC@BS组在降低细胞内游离亚铁离子方面作用最为明显，其水平接近对照组（Fig. 6D, I）。C11-BODIPY染色显示TC@BS组脂质过氧化显著降低，而Fe³⁺组则显著升高（Fig. 6E-F, J）。FTH1免疫荧光结果与FerroOrange染色趋势一致（Fig. 6G, K）。蛋白质印迹分析显示，与Fe³⁺组相比，TC、DFO和TC@BS组的FTH1和FPN表达显著增强，而TFR1和DMT1表达则显著降低（Fig. 6L, M）。综上，靶向水凝胶能减少细胞外铁积累，抑制HUVECs铁死亡，并维持细胞活性（Fig. 6N）。

图6 TC@BS体外维持HUVEC铁代谢平衡。（a）共培养实验示意图；（b）分组方案；（c）CellROX荧光图像及定量；（d）FerroOrange铁离子荧光图像及定量；（e-f）C11-BODIPY581/591脂质过氧化荧光与2.5D重建图像及定量；（g）FTH1免疫荧光图像及定量；（h-k）WB检测FTH1、TFR1、FPN、DMT1表达；（l）TC@BS在高铁微环境中抗铁死亡机制示意图。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（6）TC@BS介导的糖尿病创面修复通过减轻线粒体功能障碍的能量代谢重编程

MitoSox Red检测显示Fe³⁺组线粒体ROS荧光增强，而DFO与TC@BS水凝胶处理后荧光减弱（Fig. 7A, C）。JC-1染色表明Fe³⁺组线粒体膜电位下降，DFO与TC@BS处理可恢复膜电位，红荧光强度显著增强（Fig. 7D, E）。MitoTracker Red染色与线粒体透射电镜显示Fe³⁺组线粒体过度分裂、肿胀、嵴结构紊乱或消失，而DFO与TC@BS组线粒体分裂减少、嵴结构完整、膜结构未破坏（Fig. 7F–I）。蛋白质印迹分析表明DFO与TC@BS处理可升高Opa1、Mfn1及Mfn2表达，降低Drp1表达（Fig. 7K）。实时PCR结果显示DFO与TC@BS能够促进线粒体呼吸链复合体I、IV、V相关基因表达（Fig. 7J）。OCR检测表明Fe³⁺诱导后呼吸能力相关参数下降，TC、DFO及TC@BS处理可恢复这些参数，其中TC@BS的治疗效果强于TC和DFO（Fig. 7L）。TC、DFO及TC@BS处理可提升ATP水平并降低MDA水平，TC@BS的作用效果优于TC和DFO（Fig. 7M, N）。结果表明，TC@BS可恢复线粒体氧化代谢平衡、形态与功能，并纠正细胞能量代谢失衡（Fig. 7O）。

图7 TC@BS体外修复HUVEC线粒体功能。（a）实验分组示意；（b）MitoSOX超氧阴离子荧光图像及定量；（c-d）JC-1线粒体膜电位图像与定量；（e-f）MitoTracker线粒体形态图像及定量；（g）TEM超微结构；（h）呼吸链复合物基因RT-PCR热图；（i）WB检测Opa1、Drp1、Mfn1、Mfn2；（j）OCR曲线；（k-l）ATP与MDA含量；（m）水凝胶调控高铁微环境代谢重编程机制图。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（7）TC@BS促进糖尿病小鼠创面愈合

在STZ诱导的糖尿病小鼠模型中评估TC/DFO/TC@BS对伤口修复的影响。宏观观察图像显示，尽管所有组别的伤口面积均随时间减小，但TC@BS组在第5、10、15天时的伤口面积均小于TC组和DFO组（Fig. 8B-D）。TC@BS组的愈合效果接近未注射STZ的对照组水平。组织H&E和Masson染色显示，与第5天未见明显上皮化的DM组相比，TC/DFO/TC@BS处理的糖尿病伤口形成了结构清晰的新生表皮，其中TC@BS组效果最为显著。通过H&E结果计算伤口长度发现，术后第5天和第10天，TC@BS组的伤口长度最短，其次为DFO组、TC组和DM组（Fig. 8E-G）。

图8 TC@BS促进糖尿病鼠创面愈合。（a）动物实验流程；（b-c）创面愈合照片及示意图；（d）五组相对创面面积定量；（e-f）第5、10天H&E与Masson染色及伤口长度统计。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（8）TC@BS促进糖尿病小鼠创面血管生成，减少铁过载和脂质过氧化

激光多普勒血流成像显示，在术后第5天和第10天，TC/DFO/TC@BS处理组的伤口边缘及创面血流灌注量均高于DM组，其中TC@BS组血流灌注量接近对照组水平（Fig. 9A, F）。α-SMA免疫荧光染色表明，TC/DFO/TC@BS组在术后第5天和第10天的新生血管及成熟血管数量均多于DM组，以TC@BS组最为显著（Fig. 9B, G）。免疫组化染色显示TC/DFO/TC@BS处理可恢复伤口组织中FTH1的表达（Fig. 9C, H）。普鲁士蓝染色表明各处理组降低了体内铁离子含量（Fig. 9D, I）。4-HNE免疫荧光显示TC/DFO/TC@BS处理显著降低了体内脂质过氧化水平，TC@BS组效果最为明显（Fig. 9E, J）。伤口组织蛋白的Western blot结果与上述实验结论一致（Fig. 9K, L）。免疫荧光结果显示TC@BS可促进巨噬细胞向M2表型极化（sFig. 4A-F），并减少中性粒细胞浸润（sFig. 4G）；ELISA检测证实TC@BS降低了体内炎症水平（sFig. 4H-J）。透射电镜分析表明TC@BS处理在体内可显著改善内皮细胞线粒体形态（sFig. 9A）。血液检测及主要器官H&E染色证明TC@BS水凝胶无明显毒性（sFig. 5A-K）。结果表明，TC@BS水凝胶能显著促进糖尿病伤口血管生成，降低铁离子含量、炎症水平及脂质过氧化程度。

图9 TC@BS重塑内皮铁代谢并降低脂质过氧化以促进血管新生。（a）术后3、7天激光多普勒血流图；（b）α-SMA免疫荧光及定量；（c）FTH1免疫组化及定量；（d）普鲁士蓝铁染色及定量；（e）4-HNE免疫荧光及定量；（f-g）创面组织FTH1、TFR1、FPN、DMT1的WB分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（9）TC@BS通过激活PI3K-AKT途径抑制铁死亡

对DM组和TC@BS+DM组的伤口组织进行转录组测序分析。火山图显示两组间存在显著差异表达基因（Fig. 10A），主成分分析表明样本具有良好重复性（sFig. 8A）。KEGG富集和桑基图分析显示，PI3K-AKT信号通路与铁死亡通路在前10条通路中存在显著差异，其中铁死亡在下调生物过程中被显著抑制（Fig. 10B, sFig. 8B）。GO富集分析表明两组在脂质代谢、脂肪酸结合及NADPH氧化酶复合物等方面存在显著差异（Fig. 10C）。基因集富集分析结果与KEGG和GO分析一致（Fig. 10D-F）。两组间铁死亡相关和血管生成相关mRNA表达结果与前期实验结果相符（Fig. 10G）。结果表明靶向水凝胶可能通过上调PI3K-AKT通路抑制铁死亡，进而促进伤口愈合。

图10 TC@BS处理的RNA-seq分析。（a）TC@BS+DM vs DM差异基因火山图（红/蓝分别示显著上/下调）；（b）KEGG富集气泡图（大小示基因数，颜色示p值）；（c）GO富集（蓝、绿、橙分别对应生物过程、细胞组分、分子功能）；（d-f）GSEA铁死亡、氧化磷酸化、PI3K-AKT通路的NES与p值；（g）FTH1、SLC7A11、GPX4、VEGFA、DRP1表达验证。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，每组n = 4

（10）NOX4参与DM介导的创伤和Fe³⁺处理的人脐静脉内皮细胞铁性下垂

对经Fe³⁺处理且有无TC@BS干预的细胞蛋白进行WB分析，结果显示DFO与TC@BS处理显著促进PI3K和AKT的磷酸化（Fig. 11A–C）。IHC染色表明在体内TC@BS处理组p-PI3K和p-AKT表达高于DM组（Fig. 11D–G, sFig. 10A–D）。蛋白质相互作用网络分析显示AKT与NOX4存在强关联（Fig. 11H）。WB与IF结果显示TC@BS组显著降低NOX4表达（Fig. 11I–J, Q），IHC染色同样表明TC@BS组NOX4表达较低（Fig. 11K, L）。使用PI3K-AKT通路抑制剂LY294002进行预处理，可显著抑制PI3K-AKT通路磷酸化并促进NOX4表达（Fig. 11M–P）。结果表明TC@BS水凝胶通过激活PI3K/AKT通路并抑制NOX4表达，为糖尿病伤口提供了一种调控铁代谢和铁死亡的治疗策略（Fig. 11R）。

图11 TC@BS通过激活PI3K/AKT通路抑制NOX4介导的铁死亡。（a）PI3K、AKT及p-AKT的WB分析；（b-c）p-PI3K免疫组化图及定量；（d-e）p-AKT免疫组化图及定量；（f）蛋白互作网络图；（g-h）NOX4的WB分析；（i-j）NOX4免疫组化图及定量；（k）NOX4免疫荧光图及定量；（l-o）不同处理组p-PI3K、p-AKT与NOX4的WB分析；（p）TC@BS调控铁死亡与线粒体的信号通路示意图。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3