针对上述问题，广州医科大学冯杜教授团队提出“线粒体核样自噬（nucleoid-phagy）”新机制：发现线粒体转录因子A（TFAM）可兼做自噬受体，通过其LIR2基序直接识别并绑定LC3，将泄漏到胞质的mtDNA精准投递至自噬溶酶体降解，从而切断cGAS-STING炎症信号轴。该策略为细胞提供了“按需清除”游离mtDNA的主动防御，突破了传统整体线粒体自噬无法精细处理单分子损伤的局限。该文章于2024年05月23日以《TFAM is an autophagy receptor that limits inflammation by binding to cytoplasmic mitochondrial DNA》为题发表于《Nature Cell Biology 》（DOI：10.1038/s41556-024-01419-6）。

（1）自噬参与细胞质暴露的mtDNA和TFAM的去除

应激状态下，更多TFAM从TOM20标记的线粒体泄漏至细胞质（图1a,b）；渐进式氧化应激会降低HeLa细胞和THP-1细胞中的TFAM与SQSTM1水平，同时升高LC3-II/LC3-I比率。溶酶体抑制剂Baf-A1而非蛋白酶体抑制剂MG-132，可在不影响转录的情况下恢复TFAM（图1c,d）；自噬相关蛋白7（ATG7）基因敲除的HeLa细胞中，TFAM水平的下降被阻断（图1e,f），证实该过程依赖自噬。

通过NP-40仅通透质膜，可特异性检测逃避线粒体自噬的泄漏类核，排除线粒体与细胞核DNA的干扰；该处理成功分离细胞质组分与致密细胞器组分，证实HeLa细胞（图1g,h）和THP-1细胞中均存在TFAM向细胞质的释放，且ATG7缺陷细胞中胞质TFAM积累增强（图1i,j）。

共聚焦显微镜与PCR检测显示，应激状态下线粒体DNA（mtDNA）显著释放到胞质，Baf-A1处理后释放量进一步增加（图1k,l）；氧化应激下，ATG7缺陷细胞的胞质mtDNA较对照细胞增多（图1m-q），免疫金标记也证实这一结果（图1r-t）。

图1 自噬参与胞质暴露mtDNA和TFAM的清除（a）H₂O₂处理HeLa细胞线粒体外TFAM图像；（b）对应百分比；（c、d）H₂O₂、MG-132和Baf-A1刺激HeLa细胞的SDS-PAGE结果及统计分析；（e、f）H₂O₂刺激的ATG7缺陷型和V2对照HeLa细胞的SDS-PAGE、免疫印迹结果及统计分析；（g、i）免疫印迹验证；（h、j）对应统计分析；（k、l）ND1/ND4引物qPCR检测胞质mtDNA；（m）H2O2刺激的ATG7缺陷型HeLa细胞线粒体外mtDNA代表性图像；（n）对应百分比；（o）D-loop/ND2引物PCR检测胞质mtDNA；（p、q）ND1/ND4引物qPCR检测；（r、s）线粒体外mtDNA免疫电镜图像

（2）mtDNA-TFAM复合物与细胞质中的LC3B结合

应激条件下，HeLa和THP-1细胞中的mtDNA与TFAM仍保持结合状态（图2a–d）。亚细胞分离和细胞质DNA免疫沉淀实验显示，氧化应激会使细胞质中抗TFAM抗体上的mtDNA–TFAM复合物水平升高，且Baf-A1处理后该效应更显著（图2e–g）。通过抗LC3B抗体进行免疫共沉淀，结合RT-qPCR和PCR检测相关mtDNA发现，氧化应激下与LC3B结合的mtDNA增多，Baf-A1抑制后该水平进一步上升（图2h–j）。共聚焦显微镜观察显示，无应激时细胞质中GFP标记的LC3B（GFP-LC3B）斑点较少，经H2O2和Baf-A1处理后，GFP-LC3B水平升高且与泄漏的mtDNA共定位（图2k,l）；ATP刺激的LPS预处理THP-1细胞中，LC3B同样增多并与释放的mtDNA共定位（图2m,n）。此外，应激条件下HeLa和THP-1细胞中，LC3B与泄漏的TFAM也存在共定位（图2o–r）。

图2 mtDNA–TFAM复合物与细胞质中的LC3B结合。H₂O₂处理HeLa细胞中线粒体外mtDNA–TFAM复合物的代表性图像（a）及共定位分析（b）；LPS+ATP处理THP-1细胞中线粒体外mtDNA–TFAM复合物的代表性图像（c）及共定位分析（d）；（e）-（g）H₂O₂+Baf-A1刺激HeLa细胞胞质裂解物抗TFAM免疫沉淀，ND1（e）、ND4引物（f）qPCR及PCR（g）检测沉淀mtDNA；同上处理HeLa细胞全细胞裂解物抗LC3B免疫沉淀，PCR（h）及ND1（i）、ND4引物（j）qPCR检测沉淀mtDNA；（k）（l）（o）（p）H₂O₂+Baf-A1处理的GFP-LC3B稳定转染HeLa细胞中，胞质释放mtDNA（k、l）或TFAM-FLAG（o、p）与GFP-LC3B共定位的图像（k、o）及分析（l、p）；（m）（n）（q）（r）LPS+ATP+Baf-A1刺激THP-1细胞中，胞质释放mtDNA（m、n）或TFAM（q、r）与LC3B共定位的图像（m、q）及分析（n、r）

（3）TFAM与LC3B相互作用

氧化应激条件下，HeLa细胞胞质中TFAM-FLAG与GFP-LC3B发生共沉淀（图3a,b）；炎症和氧化应激条件下，THP-1细胞内源性LC3B与胞质TFAM共沉淀（图3c）。HeLa细胞的半下拉实验显示，内源性和外源性TFAM均可被His-LC3B下拉（图3d）。体外实验中，大肠杆菌表达并纯化的His-TFAM能下拉LC3家族的LC3A、LC3C、GABARAPL1和GABARAPL2，无法下拉GABARAP（图3e）。

（4）TFAM通过自噬溶酶体途径介导mtDNA的降解

通过 mRFP-eGFP-LC3B 区分自噬体与自溶酶体，应激条件下观察到 LC3 与 TFAM、mtDNA 的共定位增加，部分 GFP 淬灭的红色斑点提示其被递送至高酸性自溶酶体（图 4a–d）。稳定转染 GFP-LC3B 的 HeLa 细胞中，无刺激时 DsRed-TFAM 和 mtDNA 与 TOM20 标记的线粒体共定位，氧化应激后 GFP-LC3 与 TOM20- DsRed-TFAM、mtDNA 共定位增强。构建 TFAM-mRFP-eGFP 质粒后，正常条件下 TFAM-mRFP-eGFP 与 mtDNA、TOM20 标记的线粒体共定位（图4e,f）；H₂O₂刺激后，TFAM/mtDNA 斑点失去线粒体共定位并呈现 GFP 淬灭的红色荧光（图 4e–h），证实其暴露于细胞质且被递送至溶酶体。四色成像显示，应激状态下 DsRed-TFAM 与 GFP-LC3 及 LAMP1 标记的溶酶体共定位（图 4i–l），提示大量 DsRed-TFAM 脱离线粒体，与 GFP-LC3 斑点和 LAMP1 标记的溶酶体共定位。

图3 TFAM与LC3B的相互作用。（a）实验策略示意图；（b）H₂O₂和Baf-A1刺激的GFP-LC3B转染且过表达TFAM-FLAG的HeLa细胞胞浆裂解液中，anti-FLAG免疫共沉淀验证TFAM-FLAG与GFP-LC3B的相互作用；（c）LPS和ATP刺激的THP-1细胞胞浆裂解液中，anti-LC3B免疫共沉淀验证TFAM与LC3B的相互作用；（d）重组His-LC3B下拉H₂O₂和Baf-A1处理的TFAM-FLAG过表达HeLa细胞全细胞裂解液中的TFAM及TFAM-FLAG；（e）重组His-TFAM下拉重组GST-LC3B

图4 TFAM通过自噬溶酶体途径介导mtDNA降解。（a）H₂O₂处理的HeLa细胞中mtDNA与GFP淬灭的RFP-LC3B共定位代表性图像；（b）对应共定位分析；（c）H₂O₂处理的HeLa细胞中TFAM-FLAG与GFP淬灭的RFP-LC3B共定位代表性图像；（d）对应共定位分析；（e）H₂O₂处理的HeLa细胞中TFAM与mtDNA共定位代表性图像；（f）对应共定位分析；（g）（h）统计分析；（i）H₂O₂和Baf-A1刺激的GFP-LC3B稳定转染HeLa细胞中TFAM与自噬体、溶酶体共定位代表性图像；（j）对应共定位分析；（k）（l）统计分析

（5）TFAM 敲低通过 cGAS–STING 通路加剧炎症

线粒体应激增加会降低 TFAM 水平，同时激活 cGAS–STING 通路，使 HeLa 细胞和 THP-1 细胞中磷酸化干扰素调节因子 3（p-IRF3）与 IRF3 的比值升高。应激条件下，用 Baf-A1 抑制自噬会进一步增强 IRF3 磷酸化和 IFNβ 上调，无应激时也会轻微增强该信号。ATG7 缺陷 HeLa 细胞中，TFAM 水平保留较高，IRF3 激活（图 5a、b）和 IFNβ 表达（图 5c）均增加，证实 TFAM 介导的自噬降解减少会加剧该通路信号。ATG7 敲除细胞中 STING 水平升高（图 5a）；STING 敲除 HeLa 细胞中，氧化应激无法降低 TFAM 或诱导对照组中出现的 IRF3 磷酸化（图 5d–f），但胞质线粒体 DNA（mtDNA）释放情况类似。应激条件下，TFAM 敲低激活的 STING 信号会进一步增强（图 5g–j），而 STING 敲除细胞中，尽管仍保留胞质 mtDNA 应答，但 IRF3 激活被阻断（图 5k、l）。

图5 TFAM敲低通过cGAS–STING通路加重炎症。（a）ATG7缺陷和对照HeLa细胞的SDS-PAGE分析；（b）上述细胞p-IRF3/IRF3比值统计分析；（c）上述细胞IFNβ表达；（d）STING缺陷和对照HeLa细胞的SDS-PAGE分析；（e）上述细胞TFAM/β-tubulin比值统计分析；（f）上述细胞p-IRF3/IRF3比值统计分析；（g）TFAM敲低HeLa细胞的SDS-PAGE分析；（h）上述细胞p-IRF3/IRF3比值统计分析；（i）TFAM敲低THP-1细胞的SDS-PAGE分析；（j）上述细胞p-IRF3/IRF3比值统计分析；（k）H2O2处理下STING缺陷HeLa细胞的SDS-PAGE分析；（l）上述细胞p-IRF3/IRF3比值统计分析

（6）自噬受体可通过 LIR 基序与 LC3 相互作用

自噬受体可通过LIR基序与LC3相互作用，生物信息学分析预测缺失信号肽的成熟TFAM含LIR1和LIR2两个LIR基序（Fig. 6a），相关变异体质粒的表达及线粒体定位已检测。免疫共沉淀结果显示，改变LIR2而非LIR1残基会破坏与LC3B的相互作用，体外实验也证实LIR2缺失的TFAM无法拉取LC3B（Fig. 6b-d），即TFAM的LIR2基序特异性介导其与LC3B的相互作用。在氧化应激（HeLa细胞中H₂O₂处理）或炎症应激（THP-1细胞中LPS处理）下，与野生型TFAM相比，LIR2缺失的TFAM挽救的TFAM敲低细胞，其细胞质免疫沉淀复合物中检测到更多mtDNA释放（Fig. 6e-i），但LIR2改变不影响TFAM与mtDNA的相互作用；免疫荧光显示氧化应激下LIR2缺失的TFAM过表达会导致更多TFAM和mtDNA释放到细胞质（Fig. 6j-m），qPCR验证H₂O₂处理后LIR2缺陷TFAM挽救的细胞中胞质mtDNA更多，且Δ4、Δ5、Δ6变异体无显著差异，未受应激时LIR2缺陷单独不触发mtDNA释放（Fig. 6n-q），表明LIR2缺陷的TFAM无法调控自噬介导的mtDNA降解，导致胞质mtDNA积累。氧化应激会诱导线粒体膜电位丧失和ROS生成增加，但野生型与LIR2缺失的TFAM过表达挽救组在 mitochondrial 表型（膜电位、ROS）及pH敏感mt-Keima探针检测的线粒体自噬水平上均无明显差异。人TFAM与秀丽隐杆线虫HMG-5具有保守性，但HMG-5的LIR基序氨基酸序列不保守；免疫共沉淀显示氧化应激下，HMG-5的LIR缺失（尤其是Δ3，91-94位氨基酸）会干扰其与LC3的相互作用，且与野生型HMG-5相比，H₂O₂处理后过表达HMG-5 Δ3的秀丽隐杆线虫，其免疫反应（IRG-1表达）和抗氧化反应（CTL-1表达）均增强）。

图6 TFAM的LIR基序对其与LC3B的相互作用及mtDNA降解的必要性。（a）典型LIR序列与TFAM的手动比对，及TFAM上LIR1或LIR2核心残基突变或缺失相关的不同质粒示意图；（b）H₂O₂和Baf-A1处理的HeLa细胞全细胞裂解液中，用抗FLAG共免疫沉淀验证LC3B与不同TFAM-FLAG变体的相互作用（WB为蛋白质印迹）；（c）H₂O₂和Baf-A1处理的HeLa细胞全细胞裂解液中，用抗LC3B共免疫沉淀验证LC3B与LIR1核心残基缺失（Δ3）或LIR2核心残基缺失（Δ6）的TFAM-FLAG的相互作用；（d）重组GST-TFAM Δ6无法拉取重组His-LC3B；（e–i）TFAM敲低的HeLa细胞经TFAM-FLAG WT或TFAM-FLAG Δ6挽救，H₂O₂刺激后用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞质裂解物，通过qPCR检测与细胞质TFAM-FLAG结合的mtDNA；（j–m）H₂O₂处理后，TFAM敲低并经TFAM-FLAG WT或TFAM-FLAG Δ6挽救的HeLa细胞中，线粒体外mtDNA或TFAM-FLAG的共聚焦图像及百分比；（n–q）TFAM敲低的HeLa细胞经TFAM-FLAG WT或Δ6、Δ4、Δ5挽救，有无H₂O₂处理时通过qPCR（ND1、ND4引物）检测细胞质mtDNA

（7）TFAM 介导的类核自噬可减弱 cGAS–STING 炎症信号

TFAM 介导的类核自噬可减弱 cGAS–STING 炎症信号。LIR2 缺失的 TFAM 在 TFAM 敲低的 THP-1 细胞（图 7a–c）和 HeLa 细胞（图 7f–h）中，应激后磷酸化 IRF3 和 STING 水平高于野生型 TFAM 拯救组，无应激时两者表达水平相似（图 7a,f），且这些细胞中 IFNβ 表达升高（图 7d,e,i）。STING 敲除且 TFAM 敲低的 HeLa 细胞经野生型 TFAM、LIR2 缺失 TFAM、野生型 STING 或 LIR 基序改变的 STING 重构后，氧化应激下 LIR2 缺失 TFAM 与 STING LIR 变体的组合使自噬底物 SQSTM1 积累更多（图 7j,k）。线粒体功能上，LIR2 缺失 TFAM 拯救的 TFAM 敲低细胞，其线粒体膜电位 ΔΨm 在应激前后与野生型 TFAM 表达细胞无差异，基础状态下 ROS 水平更高但过氧化物处理后无此差异（图 7n,o）；两组细胞耗氧率相当，但表达 LIR2 缺失 TFAM 的线粒体更易受氧化损伤（图 7p）。TFAM 可通过结合 LC3 作为选择性自噬受体，将线粒体释放的 mtDNA 转运至自噬溶酶体降解，此即类核自噬，该途径能抵消 mtDNA 积累引发的炎症（图 7q）。