针对上述问题，浙江大学方向前/赵玥绮/唐睿康/刘昭明团队构建了一种“时空自适应”纳米递送系统，在修复早期把 NAD⁺ 精准送进促炎巨噬细胞，代谢重编程使其转向抗炎修复表型；晚期再将 NAD⁺ 靶向衰老干细胞，恢复其分化潜能。单药（NAD⁺）分阶段作用于两种功能障碍细胞，成功逆转骨质疏松小鼠的骨缺损并加速皮肤创面愈合，为代谢-纳米-再生一体化治疗提供新平台。该文章于2025年10月1日以《Spatiotemporal-adaptive nanotherapeutics promote post-injury regeneration in ageing through metabolic modulation》为题发表于《Nature Nanotechnology》（DOI：10.1038/s41565-025-02017-9）。

（1）NAD⁺作为恢复巨噬细胞与干细胞代谢稳态的潜在靶点

对老龄小鼠皮肤损伤模型在早期（4 dpi）与晚期（7 dpi）的单细胞转录组分析显示，F4/80⁺巨噬细胞与Prrx1c细胞中NAD⁺消耗酶（CD38、PARPs）显著上调（Fig. 1a–d），提示二者存在共同的NAD⁺耗竭机制。NAD⁺作为细胞代谢关键辅酶（Fig. 1e），其下降与干细胞功能衰退及免疫失衡相关。炎性巨噬细胞中CD38/PARP过度激活导致NAD⁺合成失衡与SIRT1下调（Fig. 1f,g）；SIRT1抑制NF-κB介导的炎症反应（Fig. 1h），因此NAD⁺补充有助于重编程巨噬细胞表型。然而，NAD⁺膜通透性有限（Fig. 1i），需依赖合理纳米载体实现有效递送。

基于此，构建葡萄糖修饰的巨噬细胞/干细胞杂合膜包覆NAD⁺负载ZIF-8纳米颗粒（NZM），实现炎症期与修复期的时空自适应靶向递送。炎症期NZM优先靶向促炎性巨噬细胞，通过溶酶体逃逸释放NAD⁺，诱导代谢重塑与抗炎转化；修复期NZM富集于衰老干细胞，恢复NAD⁺水平，增强线粒体功能，促进组织再生。该系统同时减弱巨噬细胞与衰老干细胞间的促炎信号互作，并在骨缺损与全层皮肤创伤模型中验证了修复效果。

图1.（a）老龄小鼠4 dpi创面UMAP分群及F4/80⁺巨噬Adgre1表达；（b）巨噬NAD⁺消耗酶热图；（c）7 dpi UMAP分群及Prrx1⁺干细胞标记；（d）干细胞NAD⁺消耗酶热图；（e）胞内NAD⁺合成-消耗通路；（f）LPS刺激巨噬NAD⁺代谢基因聚类；（g）LPS组NAD⁺及NAD⁺/NADH下降；（h）NAD⁺补充重塑巨噬表型示意；（i）NAD⁺需经胞外酶降解为NAM/NR再摄取

（2）NZM的构建与时空自适应靶向验证

ZIF-8原位矿化负载NAD⁺（载药量6.2 ± 0.44 %），粒径/晶型与空载体一致；FTIR证实羰基存在，XRD证实晶型保留（图2a、b及图1a–d）。BMSC与BMDM膜经超声-挤出融合成杂合膜（HM），共定位验证融合，冷冻电镜呈囊泡状，ζ电位–25 mV（图1e–g）。HM蛋白组GO显示膜定位富集，含SEC62、Tmed9、Gnai3、Syntaxin-7（图2c、d）。插入葡萄糖脂质得GHM，绿色荧光确认（图2e及图1h）。GHM与NZ共挤出得NZM，粒径增大，ζ电位由正转负；冷冻电镜示核-壳结构，Western blot验证膜蛋白保留（图2f–h及图1i、j）。PBS中7 d无聚集，pH 5.5下72 h NAD⁺释放达80 %（图2i、j）。炎症模型（M1:MΦ:MSC:NIH3T3=3:1:4）中，NZM对M1巨噬细胞摄取率分别是MSC与成纤维细胞的4.1倍与3.8倍；修复模型（1:3:4）中，NZM对MSC摄取率提高3.5倍（图2k–p）。在高成纤维背景正常微环境中，NZM仍保持M1/MSC选择性，未修饰颗粒无差异。

图2.（a）NZM制备示意图；（b）NZM在早期炎症期靶向巨噬细胞、晚期修复期靶向干细胞的模式图；（c）杂合膜蛋白GO细胞组分分类；（d）囊泡靶向与融合相关蛋白列表；（e）HM/DSPE-PEG2000-FITC荧光共定位及Pearson系数，标尺10 μm；（f–g）GHM、NZ、NZM的粒径与ζ电位；（h）NZ及NZM的cryo-TEM图像，标尺100 nm；（i）NZM与NZ在PBS中的胶体稳定性；（j）pH 7.4与5.0下NZM的NAD+释放曲线；（k）共培养模型模拟炎症与修复阶段的流式评估示意图；（l–m）炎症期（M1:MSC:NIH3T3=3:1:4）与修复期（1:3:4）Cy5-NZM细胞摄取流式图及MFI；（n–p）以原代成纤维细胞替换NIH3T3的炎症与修复模型中Cy5-NZM摄取MFI，n=4

（3）NZM对炎性巨噬细胞的靶向和调节作用

RNA-seq显示LPS激活的M1巨噬细胞GLUT1（Slc2a1）表达升高（图3a、b）；GHM包被Cy5-NZM在M1细胞内的摄取量高于未修饰NZ或HM-NZM，且该优势被GLUT1抑制剂phloretin取消（图3c、d）。NZM经能量依赖的clathrin介导内吞进入溶酶体，酸触发降解后时间依赖性释放NAD⁺至胞质，溶酶体完整性及酸化未受干扰（图3e、f）。NZM使LPS刺激的巨噬细胞NAD⁺及NAD⁺/NADH比值恢复，ATP升高，葡萄糖消耗与乳酸输出减少，脂质累积降低，代谢由糖酵解转向氧化磷酸化（图3g–k）。表型上，iNOS下调、ARG1上调（图3l），促炎基因Nos2、Cd86降低，抗炎基因Arg1、Cd206升高（图3m）；IL-1β、IL-6、TNF-α分泌减少，IL-10、TGF-β1、VEGF增加，CD206、CD301表达升高，LPS损伤的吞噬功能恢复（图3l–m）。

图3.（a）GLUT1介导NZM摄取示意图；（b）LPS刺激巨噬葡萄糖转运体转录组聚类；（c）Cy5染料、NZ、无糖基NZM、NZM及NZM+phloretin摄取图像，标尺50 μm；（d）流式定量Cy5阳性巨噬比例，n=5；（e）4 °C或内吞抑制剂预处理后NZM摄取流式定量，n=5；（f）Cy5-NZM与溶酶体共定位及Pearson系数，1 h与5 h，标尺10 μm，n=5；（g–h）经游离NAD⁺或NPs处理后巨噬胞内NAD⁺及NAD⁺/NADH比值，n=5；（i）胞内ATP水平，n=5；（j）实时葡萄糖与乳酸浓度，n=3；（k）Bodipy-493/503脂滴荧光强度，n=3；（l）iNOS与ARG1免疫荧光，标尺10 μm；（m）RT-PCR检测Nos2、Cd86、Arg1、Cd206表达，n=4

(4) NZM调节巨噬细胞代谢和免疫生态位

转录组显示，29 544个基因中6 276个差异表达；PCA将对照、LPS及LPS+NZM三者清晰分开（图4a–c）。GO/GSEA表明LPS抑制TCA循环、氧化磷酸化、脂肪酸及谷氨酰胺代谢并激活NF-κB/TNF信号，NZM则上调Ndufb10、Cox6b2、Idh2、Acox1等氧化代谢基因，下调IL-6通路Socs3、Stat3（图4e、f）。细胞外通量检测证实NZM恢复线粒体呼吸并抑制糖酵解（图4g、h）；线粒体膜电位及呼吸链复合体活性同步改善。¹³C-葡萄糖示踪显示糖酵解中间产物进入TCA循环的比例升高，柠檬酸、富马酸、苹果酸及衣康酸的碳交换率显著增加（图4i）。代谢组学筛选（P < 0.05，VIP > 1）发现NZM相比LPS组增加16种、减少44种代谢物；KEGG注释主要涉及有机酸、酰基脂质及氨基酸代谢（图4j）。差异代谢物显著富集于花生四烯酸代谢，NZM降低血栓烷B₂、PGE₂、11,12-EET、6-keto-PGF₁α、(±)15-HETE及PGJ₂等脂质炎症介质水平（图4j）。同时，TCA循环中琥珀酸累积减少，单酰甘油MG(20:4/0:0/0:0)、MG(0:0/20:4/0:0)及游离脂肪酸FFA(12:0)含量下降，提示脂肪酸降解加速、促炎脂质信号受抑（图4j–l）。机制上，NZM提升NAD⁺后显著增强SIRT1活性，抑制p65核转位并提高PGC1β表达（图4m）。SIRT1通过去乙酰化灭活NF-κB p65，减少促炎基因转录，同时激活PGC1β以增强线粒体氧化代谢。SIRT1抑制剂EX527可逆转NZM诱导的TCA循环、氧化磷酸化及脂肪酸氧化相关基因表达上调，并削弱抗炎效应（图4n）。此外，NZM处理巨噬细胞的条件培养基可抑制破骨细胞分化，挽救LPS受损的成骨潜能，并增强内皮细胞血管生成活性，表明其通过重塑分泌谱构建促再生微环境。

图4.（a）LPS vs LPS+NZM差异基因热图，n=3；（b）差异基因Venn图（|log2FC|≥1，adjP<0.05）；（c）PCA分离两组转录谱；（d）GO富集；（e）氧化磷酸化及脂肪酸氧化相关基因火山图；（f）GSEA示TCA、OXPHOS、FAO上调，NF-κB、IL-6、IL-17信号下调；（g–h）ECAR与OCR应激曲线，n=3；（i）U-[13C]葡萄糖示踪m+3/m+2/m+1比例，n=4；（j）差异代谢物热图，n=4；（k）KEGG通路富集；（l）脂质代谢火山图；（m）SIRT1、PGC1β核定位及p65入核定量，标尺10 μm，n=4

(5) NZM促进线粒体，防止MSC衰老

膜修饰NZM在MSC内的摄取量高于NZ。H₂O₂诱导衰老模型中，MSC的NAD⁺、NAD⁺/NADH及ATP水平下降，NZM显著回升且无明显毒性（图5a–c）。流式及SA-β-Gal染色显示NZM减少凋亡与衰老，γH2AX、p16、p21信号降低（图5d、e）。衰老/炎症基因Cdkn1a、Il6下调，周期基因Cdk4、Mki67上调。NZM降低胞质及线粒体ROS，恢复膜电位并提升OCR（图5f–j）；MitoTracker示线粒体质量增加，呼吸链复合体蛋白水平升高。线粒体调控蛋白SIRT1、PGC-1α、NRF1/2、mtTFA上调，p16、p21、p53下调（图5k）。mt-mKeima检测显示NZM增强线粒体自噬，PHB表达升高（图5l）。RNA-seq示NZM上调1 135、下调751个基因，PCA明显分离；氧化磷酸化及TCA循环基因（mt-Atp6、Ndufa4l2）富集，衰老相关Cdkn1a下调，线粒体自噬基因同步上调（图5m–o）。

图5.（a–b）游离NAD⁺或NPs处理后MSC胞内NAD⁺水平及NAD⁺/NADH比值，n=5；（c）胞内ATP，n=5；（d）SA-β-Gal染色阳性率与图像，标尺100 μm，n=4；（e）γH2AX、p21、p16免疫荧光，标尺10 μm，n=4；（f–g）MitoSOX荧光强度，标尺10 μm，n=5；（h–i）JC-1红/绿比，标尺10 μm，n=5；（j）OCR基础、最大及ATP偶联呼吸，n=3；（k）Western blot示SIRT1、PGC-1α、mtTFA、NRF1/2及γH2AX、p16、p21、p53；（l）mt-mKeima报告线粒体自噬，标尺10 μm，n=5；（m）H₂O₂衰老模型⁺NZM差异基因热图，n=3；（n）氧化磷酸化与衰老相关基因火山图（|log2FC|≥1，adjP<0.05）；（o）GSEA氧化磷酸化基因集富集

（6）NZM恢复骨质疏松症患者的骨再生能力和促进伤口愈合

体外衰老MSC经NZM处理后碱性磷酸酶活性及钙结节量显著高于NAD⁺、ZIF-8或NZ组（图6a–d），成骨蛋白与mRNA同步上调。可注射水凝胶负载Cy5-NZM，3 dpi时荧光与巨噬细胞共定位，Ly6Chigh单核/巨噬细胞Cy5-MFI高于干细胞及其他细胞（图6a、b）；14 dpi时荧光与干细胞共定位，干细胞Cy5-MFI反超其他细胞（图6c、d）。骨质疏松骨缺损模型中，NZM@Gel组4周骨愈合优于空白凝胶及NZ@Gel组；NZM-CXCL12@Gel组BV/TV与BMD最高（图6f、h）。微CT显示骨量持续增加（图6g）。4周后G5组H&E及Masson示结缔组织与类骨组织最多（图6i），病灶区NAD⁺及NAD⁺/NADH升高，OCN表达增强，ROS降低（图6j）。流式示Ly6Chi促炎单核/巨噬细胞比例由≈84%降至≈62%，CD206⁺ M2比例升高（图6k、l）；免疫荧光示iNOS下调、ARG1上调。CXCL12协同NZM招募干细胞并减少CD45⁺免疫细胞浸润，实现早期免疫调控与晚期干细胞功能恢复。全层皮肤缺损模型中，水凝胶负载NZM局部注射后滞留于创面，无全身扩散（图6m）。NZM@Gel组（G3）愈合速度显著快于未处理组（G1）及空白凝胶组（G2），NZM-CXCL12@Gel组（G4）再加速（图6n）。组织学示G3/G4再上皮化增厚、真皮再生且瘢痕减少（图6o）；Masson染色胶原沉积增加，G4新生毛囊数量最高。CD31免疫荧光显示G3/G4血管密度升高，G4干细胞招募最多。5 dpi时，G3/G4创面CD45⁺浸润减少，Ly6Chi单核/巨噬细胞比例下降，CD206⁺细胞比例上升；iNOS荧光减弱，ARG1增强（图6p）。ELISA示IL-1β、IL-6、TNF-α下调，TGF-β、IL-10上调。结果表明，该平台可序贯调控免疫、促进血管与基质重塑，显著加速创面愈合。

图6.（a）3 dpi荧光示NZM富集巨噬，（b）流式验证其跨细胞类型分布，n=5，标尺100 μm；（c）14 dpi荧光示NZM转向干细胞，（d）流式示干细胞摄取增加，n=5，标尺100 μm；（e）骨质疏松颅骨缺损实验流程；（f）颅骨缺损CT代表性图像，（g–h）2 w与4 w BV/TV及BMD定量，n=5；（i）4 周H&E与Masson染色，标尺200 μm；（j）OCN与DHE免疫荧光，标尺50 μm；（k–l）流式Ly6Chi M1比例与CD206 MFI，n=4；（m）皮肤创面实验流程；（n）0–14 d创面面积图像及定量，n=5，标尺2 mm；（o）H&E与Masson染色，标尺500 μm（d7）、400 μm（d14）；（p）治疗后第5天创面TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1、IL-10水平，n=5