研究背景：

哈佛大学医学院Howard L. Weiner教授团队受粘膜免疫系统启发，研究了鼻内给药抗CD3单克隆抗体（aCD3 mAb）治疗TBI。研究发现，该方法可诱导产生IL-10的调节性T细胞（Treg），这些细胞迁移到大脑与小胶质细胞接触，通过IL-10依赖机制减轻小胶质细胞的慢性炎症并调节其吞噬功能。阻断IL-10受体会消除aCD3 mAb的益处，而将IL-10产生型Treg细胞移植到TBI小鼠中可恢复这些效果，表明鼻内给药aCD3 mAb是治疗TBI的潜在新策略。该文章于2025年02月27日以《Nasal anti-CD3 monoclonal antibody ameliorates traumatic brain injury, enhances microglial phagocytosis and reduces neuroinflammation via IL-10-dependent crosstalk》为题发表于《Nature Neuroscience》（DOI：10.1038/s41593-025-01877-7）。

（1）经鼻 aCD3 mAb 改善 TBI 后的认知和运动结局

研究采用CCI模型评估鼻内给药抗CD3单克隆抗体（aCD3）对TBI的治疗效果。实验分为伤后4 - 6小时立即给药、伤后3天早期给药和伤后14天延迟给药，持续治疗1个月。结果显示，立即给药组在运动功能和协调性、空间记忆方面显著改善，焦虑行为减少；早期给药组运动功能和协调性、空间记忆改善，但焦虑行为未改善；延迟给药组未见改善。在更严重的TBI模型中，雄性、雌性小鼠aCD3治疗均改善运动功能和协调性，部分恢复空间记忆。雄性小鼠严重TBI后焦虑行为减少，而雌性小鼠无焦虑表型，无法评估aCD3对焦虑行为的益处。结果表明，鼻内给药aCD3可改善中度和重度TBI的行为学结果，且对雄性小鼠效果更显著。

图1 鼻内给药aCD3治疗方案及行为学测试结果。（a）治疗方案示意图；（b）立即治疗组行为学测试结果（转棒实验、水迷宫实验、探试实验、旷场实验评估焦虑行为），采用两因素重复测量方差分析（MWM测试）和单因素方差分析（其他测试），数据以均值±标准误表示；（c）伤后7天MRI脑损伤体积测量，采用双侧非配对t检验分析，数据以均值±标准误表示，红色虚线指示损伤区域；（d）伤后30天H&E染色脑切片损伤体积测量，采用双侧非配对t检验分析，数据以均值±标准误表示，比例尺1000 µm；（e）伤后7天神经元死亡免疫荧光染色（DAPI蓝、TUNEL红、7-AAD绿），比例尺200 µm（放大图500 µm），TUNEL阳性细胞通过ImageJ定量，采用双侧非配对t检验分析，数据以均值±标准误表示；（f）伤后30天小胶质细胞Iba-1免疫荧光染色（DAPI蓝、Iba-1红），比例尺200 µm（放大图500 µm），Iba-1阳性细胞通过ImageJ定量，采用单因素方差分析分析，数据以均值±标准误表示；（g）伤后1天血清生物标志物检测，采用Quanterix SiMoA和V-Plex炎症因子检测，采用单因素方差分析分析，数据以箱线图（最小值、最大值、四分位距、中位数）表示。所有数据均为两个独立实验的生物学重复

（2）CD3单克隆抗体鼻内给药改善TBI神经病理过程

研究通过多种方法评估了鼻内给药aCD3对TBI引发的神经病理学结果的影响。伤后7天，3T MRI测量显示鼻内给药aCD3组脑实质损伤体积较TBI - iso对照组减少。伤后1个月，H&E染色测量的损伤体积也显示aCD3治疗组较TBI - iso对照组减少。鼻内给药aCD3在伤后3天改善了血脑屏障（BBB）完整性，降低了TBI - iso对照组同侧半球的脑水肿百分比。TUNEL染色检测到的细胞死亡在鼻内给药aCD3治疗后减少。伤后30天，CCI增加了小胶质细胞或巨噬细胞的激活（Iba - 1染色），而鼻内给药aCD3在雄鼠中减少了这种激活。与对照组相比，鼻内给药aCD3组的几种TBI血清生物标志物减少，而抗炎细胞因子IL - 10增加。这些结果表明，鼻内给药aCD3改善了TBI小鼠的行为学表现，与神经病理学和血清生物标志物所显示的增强的组织完整性相关。

（3）aCD3单克隆抗体鼻内给药增加TBI后Treg细胞数量，改变先天性和适应性免疫格局

研究通过流式细胞术分析发现，鼻内给药aCD3在伤后1天增加颈淋巴结（cLNs）中总CD4+ T细胞和CD4+FoxP3+调节性T细胞（Treg）的比例，伤后2天增加脑膜中这些细胞的总数。鼻内给药aCD3在伤后3天和7天增加大脑中CD4+ T细胞的总数，并在伤后30天内增加CD4+FoxP3+ Treg细胞。与TBI - iso组相比，未观察到表达潜伏相关肽（LAP）的CD4+ T细胞增加。结果表明，鼻内给药aCD3通过扩大Treg细胞来控制TBI后的神经炎症。

（4）aCD3单克隆抗体鼻内给药诱导的Treg细胞有独特的免疫调节特征

鼻内给药aCD3在伤后30天内增加了CD4+FoxP3+调节性T细胞（Treg）。对CCI后7天从假手术和受伤小鼠的脑周损伤组织和血液中分离的CD4+FoxP3(GFP)+ Treg细胞进行RNA测序分析。主成分分析（PCA）显示，TBI后脑内FoxP3 Treg细胞的转录组特征与血液中的显著不同。与假手术小鼠的血液Treg细胞相比，TBI小鼠脑内浸润的Treg细胞中多种免疫调节和营养因子基因表达增加。鼻内给药aCD3处理的小鼠血液中的FoxP3 Treg细胞具有独特的转录组特征，涉及Treg细胞增殖和稳态以及Treg细胞功能的基因上调。通路分析（IPA）显示，与TBI - iso FoxP3 Treg细胞相比，aCD3诱导的FoxP3 Treg细胞中IL - 10是最主要的上游激活调节因子。进一步分析发现，TBI和鼻内给药aCD3处理的小鼠脑内浸润的Treg细胞中，免疫调节相关基因表达上调。此外，aCD3诱导的Treg细胞中，免疫调节、吞噬调节、神经营养因子、脂质稳态以及其他Treg细胞免疫抑制功能所需基因的表达进一步增加。基因集富集分析（GSEA）和通路分析（IPA）显示，与假手术对照组和TBI - iso组相比，TBI - aCD3处理的小鼠脑内Treg细胞中涉及迁移、免疫反应调节、吞噬、神经发生、稳态和分泌功能的生物通路富集。通路分析（IPA）识别出IL - 10和Stat3是TBI小鼠脑内aCD3处理的Treg细胞中最主要的上游激活调节因子。流式细胞术分析显示，与TBI - iso对照组相比，aCD3处理的小鼠脑内Treg细胞中IL - 10表达上调。这些结果表明，外周和中枢Treg细胞具有独特的免疫调节特征，与鼻内给药aCD3治疗TBI后的改善相关。

（5）aCD3单克隆抗体鼻内给药调节小胶质细胞炎症反应

鼻内给药aCD3增加了FoxP3+调节性T细胞（Treg）向脑膜和CCI损伤部位的迁移，这些细胞在损伤后与小胶质细胞树突密切接触。小胶质细胞单细胞悬浮液的RNA测序分析显示，在伤后7天，TBI - iso和TBI - aCD3组的小胶质细胞转录组特征相似，但到伤后30天，TBI - aCD3组的小胶质细胞转录组特征向假手术对照组表型转变，表现为下调促炎基因（如Il6、Il18）和上调稳态基因（如Tgfbr2、Mertk）。在伤后7天，鼻内给药aCD3处理的小胶质细胞中，稳态和感知相关基因（如Cd33、Lag3）表达增加，且下调促炎关键调节因子Cd14。伤后30天，aCD3处理增加了TGF - β信号通路基因表达（如Smad3、Tgfbr1），并下调了细胞因子受体和模式识别受体相关基因（如Tnfrsf17、Cd74）。基因集富集分析（GSEA）表明，在伤后7天，TBI - iso组上调氧化应激和神经元凋亡相关通路，而TBI - aCD3组在这些通路中的基因上调较少，且在抗炎IL - 10产生和吞噬相关通路中基因上调更多。伤后30天，TBI - iso组在促炎机制和细胞杀伤通路中基因表达富集，而TBI - aCD3组在这些通路中的基因上调较少，且在吞噬和细胞因子产生相关通路中基因上调更多。分析伤后30天的炎症反应基因和疾病相关小胶质细胞（DAMs）、神经退行性小胶质细胞（MGnDs）特征基因发现，TBI - iso小胶质细胞具有促炎反应和DAM或MGnD特征，而aCD3处理的小鼠中这些基因表达下调，接近假手术组水平。定量PCR（RT - qPCR）显示，鼻内给药aCD3在伤后7天增加小胶质细胞和脑组织中抗炎细胞因子Il10的表达，并在伤后30天减少促炎标志物表达，同时上调脑源性神经营养因子（Bdnf）。这些结果表明，鼻内给药aCD3使小胶质细胞从病理性的、疾病相关表型转变为有益的、稳态表型。

（6）鼻腔 aCD3 以 IL-10 依赖性方式增加小胶质细胞吞噬作用

TBI - aCD3处理的小鼠在伤后7天吞噬相关生物学通路显著上调，且在伤后30天多种关键小胶质细胞吞噬调节因子（Mertk、Sirpa和Tlr4）表达增加。实验在伤后6天和7天分别注射标记的凋亡神经元或PBS，并在注射后16小时和4小时检测，结果显示aCD3处理的小鼠在注射后4小时和16小时的吞噬能力均高于TBI - iso组。对伤后7天的吞噬性和非吞噬性小胶质细胞进行RNA测序分析，结果显示吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞在注射后4小时表现出独特的转录组特征，涉及多种关键吞噬基因的上调。与非吞噬性TBI - iso小胶质细胞相比，吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞在识别和吞噬凋亡细胞及碎片（Mertk、Mrc1、Abca1、Lrp1和Stab1）、消化降解吞噬物（Rab27a、Smcr8、Clec16a和Vps8）、脂质代谢（Apoc1、Olr1和Ldlr）、细胞骨架动态（Myo1e）和调节小胶质细胞吞噬（Tspo、Qk和Pik3cg）的基因表达增加。基因集富集分析（GSEA）显示，与非吞噬性TBI - iso小胶质细胞相比，吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞在吞噬相关通路（包括内吞、模式识别和细胞迁移）中显著富集。此外，与吞噬性TBI - iso小胶质细胞相比，吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞在抗原呈递和IL - 10通路的上调更为显著。通路分析（IPA）显示，IL - 10是aCD3处理的吞噬性小胶质细胞中最重要的调节因子和信号通路。在伤后16小时，也观察到类似的吞噬机制相关基因和通路的上调，且吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞表现出更稳态、更少炎症（疾病相关）的特征。使用IL - 10基因敲除（KO）小鼠重复小胶质细胞吞噬实验，结果显示IL - 10 KO小鼠中TBI - aCD3小胶质细胞在注射后4小时的吞噬能力显著降低，且与野生型（WT）TBI - iso小胶质细胞相比，IL - 10 KO小鼠的TBI - iso小胶质细胞吞噬能力显著降低。这些结果表明，鼻内给药aCD3通过IL - 10依赖的方式增强了小胶质细胞的吞噬机制。

图4 小胶质细胞吞噬功能的表征及鼻内给药aCD3的影响。（a）伤后7天小胶质细胞吞噬相关基因的热图，基因通过DESeq2分析（双侧似然比检验，每组n = 4只小鼠）鉴定，FDR校正P < 0.05的基因用星号表示；（b）吞噬功能实验示意图；（c）伤后7天损伤部位的免疫荧光染色（凋亡神经元蓝、P2ry12红），显示P2ry12吞噬凋亡神经元，比例尺100 µm（放大图50 µm）；（d）注射标记的凋亡神经元后4小时的小胶质细胞吞噬实验，数据以箱线图表示，每组n = 5只小鼠，采用双侧非配对t检验分析；（e）伤后7天及凋亡神经元注射后4小时，吞噬性（+P）和非吞噬性（-P）小胶质细胞的差异表达基因（DEGs）聚类热图（DESeq2分析，双侧似然比检验，每组n = 3 - 4只小鼠，FDR校正P < 0.05）；（f）与小胶质细胞吞噬及相关功能相关的基因在TBI - iso（+P）与TBI - iso（-P）以及TBI - aCD3（+P）与TBI - iso（-P）比较中的log2（倍数变化）条形图；（g）基于上述比较的基因集富集分析（GSEA），q值 < 0.05的富集项用星号表示；（h）与吞噬性TBI - iso小胶质细胞相比，吞噬性TBI - aCD3小胶质细胞的DEGs的通路分析中选择的顶级典型通路；（i）TBI - aCD3（+P）与TBI - iso（-P）比较中预测的上游调节因子；（j）与（b）相似设计的吞噬实验，数据以箱线图表示，每组n = 5只小鼠，采用单因素方差分析分析。所有数据均为生物学重复，代表两个独立实验

（7）鼻腔 aCD3 通过小胶质细胞中的 IL-10/IL-10R 信号转导改善 TBI 预后

在伤后7天，TBI - aCD3组小胶质细胞的IL - 10细胞因子基因表达显著上调。鼻内给药aCD3诱导分泌IL - 10的Treg细胞，并在损伤部位的小胶质细胞和脑组织中增加IL - 10表达。通过腹腔注射抗IL - 10R（aIL - 10R）阻断抗体，每3天一次，研究假手术 - iso、TBI - iso、TBI - aCD3和TBI - aCD3 + aIL - 10R组的行为学结果和血脑屏障（BBB）破坏情况。结果显示，TBI - aCD3组在BBB破坏以及运动协调功能、空间记忆和焦虑样行为方面的改善被IL - 10R阻断抵消。RNA测序分析发现，伤后1个月，鼻内给药aCD3对小胶质细胞的调节作用被IL - 10阻断，小胶质细胞热图显示TBI - aCD3 + aIL - 10R组表现出更促炎的转录组特征，且稳态标志物表达减少。使用IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2条件性敲除（KO）小鼠及其同窝对照小鼠，研究小胶质细胞IL - 10R敲除对行为学和小胶质细胞吞噬能力的影响，发现经他莫昔芬处理的TBI - aCD3 - IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2小鼠表现出更差的运动和认知结果以及降低的小胶质细胞吞噬能力。这些结果表明，IL - 10/IL - 10R信号在增强小胶质细胞吞噬能力和改善TBI疾病中起关键作用。

（8）鼻腔 aCD3 诱导的 CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞改善神经炎症和 TBI 结果

鼻内给药aCD3在伤后3天至30天增加了损伤部位的FoxP3+ Treg细胞，并通过减少小胶质细胞炎症改善了TBI的行为学和神经病理学结果。过继转移实验中，接受aCD3处理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg细胞的小鼠在伤后7天表现出改善的运动功能和协调性，并恢复了空间记忆。对TBI - aCD3 - FoxP3+、TBI - iso - FoxP3+和TBI - aCD3 - FoxP3− GFP组小鼠损伤侧半球的小胶质细胞进行RNA测序分析，发现TBI - aCD3 - FoxP3+小胶质细胞与其他组相比具有独特的转录组特征。基因集富集分析（GSEA）显示，与TBI - aCD3 - FoxP3−小胶质细胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小胶质细胞下调了包括干扰素（IFN）γ和IFNα在内的多种促炎通路。通路分析（IPA）揭示IL - 10Ra是TBI - aCD3 - FoxP3+小胶质细胞中最重要的上游激活调节因子之一，而IL - 1b是最重要的上游抑制调节因子之一。与TBI - iso - FoxP3+小胶质细胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小胶质细胞中IFNγ是最显著下调的调节因子之一。定量PCR（RT - qPCR）显示，与另外两组相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小胶质细胞中促炎细胞因子减少，稳态和抗炎细胞因子表达增加。接受aCD3处理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg细胞的小鼠在伤后7天增加了小胶质细胞的吞噬能力。这些结果表明，FoxP3+ Treg细胞在增强小胶质细胞吞噬能力和改善TBI疾病中起关键作用。

图6 Treg细胞对TBI后行为学和小胶质细胞炎症的影响。（a）过继转移实验时间线；（b）转棒实验和Y迷宫测试结果，数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析分析；（c）伤后7天小胶质细胞的差异表达基因（DEGs）聚类热图，基因通过DESeq2分析（双侧Wald检验，每组n = 3只小鼠，FDR校正P < 0.05）鉴定，聚类用基因本体生物学过程（GOBP）富集项（q值 < 0.05）注释；（d）基因集富集分析（GSEA）分析TBI - iso FoxP3与TBI - aCD3 - FoxP3−以及TBI - aCD3 - FoxP3与TBI - aCD3 - FoxP3−的比较，q值 < 0.05的富集项用星号表示；（e）TBI - aCD3 - FoxP3与TBI - aCD3 - FoxP3−比较的预测上游调节因子（通路分析）；（f）TBI - aCD3 - FoxP3与TBI - iso FoxP3比较的基因集富集分析；（g）TBI - aCD3 - FoxP3与TBI - iso FoxP3比较的预测上游调节因子（通路分析）；（h）伤后7天损伤侧半球小胶质细胞的定量PCR分析，以GAPDH为内参，数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析分析；（i）与图4b相似设计的小胶质细胞吞噬实验，数据以箱线图（最小值、最大值、四分位距、中位数）表示，采用单因素方差分析分析；（j）小胶质细胞和Treg细胞共培养示意图；（k）小胶质细胞的定量PCR分析，以GAPDH为内参，数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析分析。所有数据均为生物学重复，代表两个独立实验

（9）CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞在体外抑制小胶质细胞炎症和稳态标志物

采用体外共培养系统，从小鼠CCI损伤后24小时的损伤侧半球分离小胶质细胞，并从接受CCI和鼻内给药aCD3或同型对照处理7天的小鼠脾脏中分离Treg细胞。共培养72小时后对小胶质细胞进行定量PCR分析，结果显示，与TBI - iso组相比，TBI - aCD3组小胶质细胞中抗炎和稳态标志物（Il10、Cx3cr1和Cd206）增加，促炎标志物Il1b减少，这与伤后7天的体内小胶质细胞转录组数据一致。此外，通过体外阻断IL - 10，这种效应消失，这也与体内IL - 10中和后的观察结果一致。

（10）产生IL-10的Treg细胞促进小胶质细胞吞噬、改善神经炎症及功能预后

鼻内给药aCD3处理小鼠的FoxP3 Treg细胞过继转移可改善TBI，且IL - 10在其中发挥重要作用。利用FoxP3 - DTR转基因小鼠耗竭FoxP3 Treg细胞，白喉毒素（DT）在CCI前3天注射，并每3天重复一次，直至CCI或假手术后7天。结果表明，FoxP3 Treg细胞的耗竭恶化了运动功能，加剧了小胶质细胞炎症，并增加了促炎小胶质细胞标志物（Il1b、Tnf、Il6和Il18）的表达。FoxP3 Treg细胞的耗竭降低了小胶质细胞吞噬死亡神经元的能力。使用10BiT.FoxP3GFP双重报告系统分离IL - 10+和IL - 10− Treg细胞，并将这些细胞过继转移至FoxP3耗竭小鼠中，观察到IL - 10+ Treg细胞与IL - 10− Treg细胞相比，改善了运动功能和空间记忆，降低了促炎标志物的表达，并且增强了小胶质细胞对死亡神经元的吞噬能力。因此，IL - 10在鼻内给药aCD3诱导的FoxP3 Treg细胞对TBI的有益效果中起关键作用。