为了解决上述问题，中国药科大学苏志桂教授、涂家生教授和姜雷研究员联合团队开发了一种多功能纳米平台（_siTTENPs），用于动脉粥样硬化治疗。该平台由阳离子树状脂肽、PLGA聚合物、靶向脂质和治疗性核酸组成，能够靶向递送至病变巨噬细胞，实现特异性TRPM2基因敲低以抑制泡沫细胞形成，并通过环糊精增强胆固醇外流。体内外实验表明，该平台显著提高了靶向效率和胆固醇代谢调节能力，有效降低了主动脉斑块负荷，展现了良好的治疗潜力。该文章于2025年6月27日以《Lesional Macrophage-Targeted Nanomedicine Regulating Cholesterol Homeostasis for the Treatment of Atherosclerosis》为题发表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202502581）。

图1 _siTTENPs（_siTRPM2靶向及外排增强纳米粒子）的制备工艺及在动脉粥样硬化治疗中的应用策略图解。A）siTTENPs的关键成分。B） siTTENPs的制备工艺。C） siTTENPs治疗动脉粥样硬化的综合治疗策略。i：靶向病变巨噬细胞。ii：抑制oxLDL的摄取和泡沫细胞的形成。iii：促进泡沫细胞胆固醇的外排。iv：降低炎症因子水平

（1） _siTTENPs的制备与表征

合成阳离子树状脂肽G2K以增强siRNA稳定性，促进细胞摄取和内质网释放（图S1、S2）。S2P肽通过马来酰亚胺化学连接到DSPE-PEG2000-Mal用于靶向（图S3），β-环糊精通过酰胺化反应连接到DSPE-PEG2000-NHS用于增强胆固醇外流（图S4）。正交实验优化了纳米粒配方，确定_siTTENPs的摩尔比为DSPE-PEG-S2P:DSPE-PEG-β-CD:G2K:PLGA = 18:18:26:10（图2B、C、D）。_siTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs的粒径分别为185 ± 5.0 nm、161 ± 6.0 nm、162 ± 5.0 nm和130 ± 4.0 nm，zeta电位接近中性，结构呈球形且均匀（图2E、F、G、H）。在N/P比为20时，_siTTENPs对_siTRPM2的包封效率最高（图S5），且在含25%血清的溶液中孵育12小时后仍具有抗核酸酶降解能力，而游离siRNA在3小时内完全降解（图S6）。在PBS或10% FBS溶液中孵育72小时后，_siTTENPs粒径无显著变化，表现出良好的稳定性（图2I、J）。

图2 _siTTENPs的制剂筛选与表征。A) _siTTENPs的关键组分及正交筛选。B) _siTTENPs的正交筛选矩阵。C) 使用正交筛选软件，以四种组分设计九种制剂的摩尔比。D) 体外评估九种制剂的基因转染效率，并以此作为筛选标准，使用该软件确定最佳制剂。_siTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs的表征： E )粒径， F )多分散指数 (PDI)，G) zeta电位，H) 透射电子显微镜 (TEM) 图像（比例尺：100 nm）。_siTTENP 在 PBS 和 10% FBS 中的稳定性：I) 粒度，J) PDI（n = 3，数据表示为平均值±SD；使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行 Tukey 事后检验）

（2）_siNTENPs的细胞摄取和内化

研究通过LPS诱导RAW264.7细胞炎症，模拟病变巨噬细胞环境，评估了不同纳米粒的细胞摄取和内质网逃逸能力。CLSM（图3B）和流式细胞术（图3C）结果显示，靶向修饰的_siNTNPs和_siNTENPs细胞摄取效率显著高于对照组（_siNNPs和_siNENPs），且在病变巨噬细胞中表现出更高的摄取能力（图S7）。摄取机制研究（图S8）表明，_siNTENPs通过洞穴体和网格蛋白介导的内吞途径进入细胞，且依赖能量。内质网逃逸实验（图3D）显示，_siNTNPs和_siNTENPs在细胞摄取3小时后与溶酶体共定位，6小时后成功逃逸至细胞质，其中_siNTENPs的逃逸效率最高（图S9）。此外，MTT实验（附录图S10）表明，_siTTENPs在高浓度下对病变巨噬细胞的毒性较低，细胞活性保持在80%以上。

图3 siN TENPs的体外细胞摄取和内化。A）实验流程：通过流式细胞术、细胞术和激光扫描共聚焦显微镜 (CLSM) 评估_siNTENPs 的细胞摄取。B）_siNTENPs 处理 RAW264.7 细胞 4 小时后的 CLSM 图像。_siNTENPs 为绿色（用 FITC 标记） ，细胞核为蓝色（用 Hoechst 标记）。_siNTENPs的浓度为 2.4 µg mL⁻¹ （比例尺：10 µm）。C）_siNTENPs 处理 4 和 8 小时后对 RAW264.7 细胞进行流式细胞术分析。_siNTENPs的剂量为 2.4 µg mL⁻¹。 D) 分析了用_siNTENPs 处理 3 和 6小时的RAW264.7 细胞的 CLSM 图像，以监测细胞内化情况

（3）_siTTENPs调节胆固醇稳态的体外研究

β-CD可增强胆固醇溶解和外流。本研究合成DSPE-PEG-β-CD构建_siNTENPs。实验中，用LPS和NBD-胆固醇诱导RAW264.7细胞形成泡沫细胞，再与不同制剂共孵育。CLSM（图4A）显示，含DSPE-PEG-β-CD的_siNENPs和_siNTENPs组在2小时时绿色荧光显著降低，表明胆固醇外流增强；流式细胞术（图4B）显示_siNTENPs组4小时后细胞内胆固醇水平降低约50%。ELISA（图4C、D）显示siTTENPs显著降低TNF-α和IL-1β分泌。油红O染色（图4E、F）显示_siTTENPs组细胞内脂质积累显著减少，吸光值最低。Western blot（图4H、I）显示，_siTTENPs显著下调TRPM2和CD36蛋白表达，抑制TRPM2-CD36炎症轴。下游蛋白pFyn和pJNK表达趋势与TRPM2和CD36一致（图4J、K）。结果表明，_siTTENPs通过抑制TRPM2-CD36轴减少泡沫细胞形成，并通过β-CD增强胆固醇外流，调节脂质稳态，有望成为治疗动脉粥样硬化的新型策略。

图4 _siNTENPs调节巨噬细胞脂质稳态。（a）CLSM图像显示RAW264.7细胞经β-CD或_siNTENPs处理2小时和4小时后的胆固醇（绿色，NBD标记）和细胞核（蓝色，DAPI标记）分布（比例尺：20 µm）；（b）流式细胞术分析细胞内胆固醇水平；（c）和（d）ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-1β水平；（e）和（f）油红O染色观察_siTTENPs处理36小时后泡沫细胞内脂滴（比例尺：50 µm）及定量分析；（g）小鼠主动脉细胞中TRPM2表达的t-SNE图；（h）Western blot检测泡沫细胞中TRPM2/CD36轴蛋白表达；（i）Western blot检测泡沫细胞中TRPM2和CD36蛋白表达及定量分析；（j）和（k）Western blot检测泡沫细胞中下游蛋白pFyn和pJNK表达及定量分析（n=3，数据以均值±标准差表示；采用单因素方差分析后接Tukey事后检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示无显著差异）

（4）siTTENPs 治疗通过靶向主动脉血管改善ApoE^−/−小鼠的动脉粥样硬化

ApoE^−/−小鼠高脂饮食8周后静脉注射_siTTENPs 3周，主动脉油红O染色（图5A）显示，生理盐水组斑块显著多于其他组，_siTTENPs组斑块面积显著减少（附录图S12），斑块负荷较生理盐水组降低3.8倍（图5H）。血清脂质分析显示，_siTTENPs组TC、LDL-C和TG显著降低，HDL-C显著增加（图5C、F）。ELISA检测显示，_siTTENPs组血清中TNF-α和IL-1β水平显著低于生理盐水组（图5I、J）。这些结果表明，_siTTENPs可抑制泡沫细胞形成，促进胆固醇外流，协同促进斑块消退。

进一步研究_siNTENPs的体内靶向能力，WT小鼠和ApoE^−/−小鼠高脂饮食后静脉注射Cy5.5标记的_siNTENPs。成像结果显示，_siNTENPs在WT小鼠主动脉中无显著荧光，而在ApoE^−/−小鼠主动脉中荧光显著（图5K）。定量分析显示，注射后4小时，_siNTENPs组荧光强度约为_siNENPs组的3.5倍（图5G），表明_siNTENPs可快速靶向并积累于主动脉斑块区域，12小时后部分代谢。综上，_siTTENPs通过靶向主动脉斑块，实现斑块消退、改善血脂和调节炎症环境，为动脉粥样硬化治疗提供新策略。

图5 _siTTTENPs通过靶向主动脉血管改善ApoE^−/−小鼠的动脉粥样硬化。（a）体内实验示意图：小鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型，分为5组（n=6），分别静脉注射生理盐水、s_iTNPs、_siTTNPs、_siTENPs和_siTTENPs（_siTRPM2剂量为3 mg/kg）；（b）油红O染色观察各组小鼠主动脉整体情况及血脂分析：（c）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、（d）总胆固醇（TC）、（e）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和（f）甘油三酯（TG）；（g）小鼠主动脉荧光强度定量分析；（h）小鼠斑块面积统计分析（n=6）；（i）和（j）通过ELISA检测小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平；（k）8周龄雄性野生型（WT）小鼠和ApoE^−/−（高脂饮食）小鼠静脉注射1.6 mg/kg的Cy5.5标记的siNENPs和siNTENPs后进行主动脉成像（siN：Cy5.5标记的siNC）（n=3，数据以均值±标准差表示；采用单因素方差分析后接Tukey事后检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示无显著差异）

（5）_siTTENPs通过下调体内CD 36积极促进巨噬细胞脂质沉积

为深入探究_siTTENPs减轻动脉粥样硬化进展的具体机制，对主动脉根部进行显微镜观察、免疫荧光和免疫组化分析。偏振光下观察主动脉根部胆固醇晶体，与生理盐水组相比，_siTNPs、_siTTNPs和_siTENPs组膜更厚、晶体更多，而_siTTENPs组膜更薄、晶体更少（图6A）。图像分析显示，_siTNPs、_siTTNPs和_siTENPs组晶体面积均有所减少，但_siTTENPs组晶体面积最小，不到5%（图6B）。免疫荧光和免疫组化分析显示，与生理盐水组相比，_siTTENPs和_siTTNPs组CD36阳性表达显著降低，_siTTENPs组CD36阳性表达最低，平均值为2%（图6C）。CD68/DAPI荧光比值分析显示，_siTTENPs和_siTTNPs组促炎巨噬细胞显著减少，_siTTENPs组比值最低，平均为0.2（图6D、E）；而_siTTENPs组抗炎巨噬细胞标志物CD206/DAPI荧光比值最高，平均值为1.0（图6F、G）。此外，通过苏木精-伊红（H&E）染色和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）分析研究主动脉根部斑块的坏死核心和斑块不稳定性，_siTTENPs和_siTTNPs组坏死核心面积和MMP-9阳性表达显著减少，_siTTENPs组最低，分别为17.8%和2%（图6H、I、J）。综上，_siTTENPs通过环糊精的胆固醇溶解作用和下调CD36表达，促进胆固醇外流、减少泡沫细胞形成，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

图6 _siTTENPs通过下调CD36减少巨噬细胞脂质沉积。（a）小鼠心脏组织切片中胆固醇晶体和CD36的免疫染色图像（比例尺：300 µm、500 µm）；（b）胆固醇晶体的定量分析；（c）CD36⁺细胞的定量分析；（d）CD68的免疫染色图像（比例尺：200 µm）；（e）CD68/DAPI荧光强度比值的定量分析；（f）CD206的免疫染色图像（比例尺：200 µm）；（g）CD206/DAPI荧光强度比值的定量分析；（h）苏木精-伊红（H&E）染色和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的免疫染色图像（比例尺：500 µm）；（i）坏死核心的定量分析；（j）MMP-9⁺面积的定量分析（n=3，数据以均值±标准差表示；采用单因素方差分析后接Tukey事后检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示无显著差异）

（6）_siTTENPs体内安全性评价及生物分布

研究评估了_siTTENPs的体内安全性。结果显示，治疗期间小鼠体重无显著变化（图S13）。溶血率低于5%，表明溶血活性低（图7A）。成像显示_siTTENPs主要在肝脏和肾脏积累（图7B），荧光强度分析表明肝脏最高，其次是肾脏（图7C、G）。CBC检测显示，_siTTENPs组与对照组在血液指标上无显著差异（图S14）。血清生化检测显示，肝功能和肾功能指标均在正常范围内（图7D–J）。H&E染色显示，_siTTENPs组的肝肾组织外观正常，心、脾、肺组织细胞形态也正常（图7K及图S15）。综上，_siTTENPs主要通过肝肾代谢，具有良好的体内安全性和低毒性。

图7 _siTTENPs的体内安全性评价及生物分布。（a）_siTTENPs溶血率，阳性对照（PC）：水，阴性对照（NC）：生理盐水；（b）Cy5.5标记的siNCs的生物分布；（c、g）器官中Cy5.5荧光强度的定量分析：（c）4小时和（g）12小时；（d–f）通过（d）AST、（e）ALT和（f）ALP水平评估肝功能指标；（h–j）通过（h）BUN、（i）UREA和（j）UA水平评估肾功能指标；（k）肝脏和脾脏组织的苏木精-伊红（H&E）染色代表性图像（比例尺：250 µm）（n=3，数据以均值±标准差表示；采用单因素方差分析后接Tukey事后检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；ns表示无显著差异）