针对上述问题，中南大学开天瀚、丁平团队合作开发了一种可响应ROS、pH、近红外(NIR)与电刺激(ES)四种信号的导电水凝胶（HEPP）：以透明质酸（HA）-苯硼酸（PBA）-聚赖氨酸-咖啡酸为骨架，负载Ti/Pt–Pd双金属纳米酶与葡萄糖氧化酶(PTPPG)。当感染创面pH下降时，PTPPG启动级联酶反应（POD、OXD、GOx）产生活性氧并与温和光热/光动力效应协同杀菌并耗竭局部葡萄糖、缓解缺氧；NIR照射与ES联合促进血管新生并引导巨噬细胞由 M1 向 M2 极化；当创面ROS过量时，咖啡酸多酚基团即时清除活性氧，防止二次损伤。该水凝胶集抗菌、供氧、ROS 调控、抗炎及电刺激于一体，可为糖尿病慢性创面的精准管理提供新策略。该文章于2025年5月8日以《An Intelligent and Conductive Hydrogel with Multiresponsive and ROS Scavenging Properties for Infection Prevention and Anti-Inflammatory Treatment Assisted by Electrical Stimulation for Diabetic Wound》为题发表于《AdvancedS Science》上（DOI：10.1002/advs.202500696）。

研究示意图

（1）PTPPG纳米颗粒的合成与表征

如图2A所示，首先先以溶剂热法将Ti掺入PCN-224得PCN-224(Ti)，再原位沉积Pt–Pd，最后经表面吸附GOx形成PTPPG，使其兼具GOx、POD、CAT、OXD活性。图2B~C PTPPG的SEM及TEM图显示PTPPG呈直径约为100 nm球形的结构。图2D的EDS形貌表征提示C、N、O、Zr、Ti、Pt、Pd在PTPPG表面均匀分布。图2E中Zeta电位负移证实GOx吸附且表面电荷稳定。图2F-K中各组分精细峰的变化及XRD中特征峰的出现进一步证明了PTPPG的成功制备。图2L显示，PTPPG在0-100℃范围下具有良好的热稳定性。

图1. PTPPG纳米颗粒的合成与表征。A) PTPPG合成流程示意图；B) PTPPG的SEM图；C) PTPPG的TEM图；D) PTPPG的EDS形貌与元素分布；E) PCN-224、PCN-224(Ti)、PTPP及PTPPG的Zeta电位；F) PTPPG的XPS全谱；G) Zr 3d；H) Ti 2p；I) Pt 4f；J)Pd 3d的高分辨图谱；K) PCN-224、PCN-224(Ti)和PTPPG的XRD图谱；L) PTPPG的热重曲线

（2）PTPPG的多酶活性及光响应性

为了在体外评估PTPPG的多种酶活性，如GOx、CAT、POD、OXD和光响应性等（图2A）。首先，在酸性条件下，以TMB为底物验证了PTPPG的POD与OXD活性（图2B）。接着利用葡萄糖作为底物，在pH 4（酸性）及pH 7.4（中性）条件下评估了其催化葡萄糖氧化的能力，结果显示PTPPG确有良好的葡萄糖氧化能力（图2C-D）。然后借助KMnO₄检测反应体系，实验观察到PTPPG作用后KMnO₄吸光度明显下降，证明H₂O₂已被有效生成（图2E）。该吸光度的衰减在酸性条件下尤为显著，提示PTPPG具有高效的GOx活性。最后，以Ru(ddp)（三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)二氯化物）为氧敏荧光指示剂验证了CAT活性，由结果可知，PTPPG与H₂O₂共存时，Ru(ddp)荧光被显著猝灭，提示H₂O₂被分解并释放氧气（图2F-G），而这也有助于缓解伤口缺氧状态。为评估 PTPPG 的光动力性能，采用了单线态氧传感器绿色（SOSG）荧光探针，结果显示，在 660 nm 激光照射下，单线态氧（¹O₂）的产量表现出对激光功率密度和 PTPPG 浓度的依赖性，即随二者增加而上升（图2H）。另外利用EPR（电子顺磁共振光谱）分析进一步确认在反应过程中羟基自由基（•OH）、单线态氧（¹O₂）和超氧阴离子自由基（•O₂⁻）的产生（图2I-J）。此外，PTPPG 还展现出一定的光热性能。在808 nm 近红外激光辐照下，其表现出明显的光热效应，溶液温度的升高与PTPPG浓度和激光功率呈正相关（图2K-M）。实验测得其光热转换效率可达30.1%（图2O-P）。值得注意的是，在多次加热-冷却循环中，PTPPG仍能保持了良好的光热稳定性（图 3N-P）。

图2. PTPPG的多酶活性及光响应性表征。A) PTPPG多重酶活及光响应示意图；B) PTPPG与H₂O₂及TMB共孵育验证氧化酶/过氧化物酶活性；C)以TMB/OPD为底物分别测定pH 4及D）pH7.4下PTPPG的葡萄糖氧化酶活性；E) KMnO₄验证葡萄糖氧化反应产H₂O₂；F) PCN-224、PCN-224(Ti)、PTPP及PTPPG的Zeta电位；F) Ru(ddp)验证PTPPG催化H₂O₂产氧；G）Ru(ddp)实时监测PTPPG在H₂O₂或Glu存在下的氧气生成；H）SOSG探针检测PTPPG光动力产¹O₂；I）EPR捕获•OH、¹O₂、•O₂⁻自由基；J）660 nm激光照射前后的EPR对比；K）808 nm激光照射下不同浓度PTPPG红外热成像；L）不同PTPPG浓度下的升温曲线；M）不同功率下的升温曲线；N）808 nm激光（0.9 W）下，五次循环加热/冷却稳定性；O）100 μg mL⁻¹ PTPPG在808 nm（0.9 W）照射及关闭后的温度变化；P）−ln(θ)与时间线性拟合求光热转换效率

（3）HEPP的合成与表征

如图3A所示，水凝胶HEPP由动态席夫碱键、硼酸酯键及PDA@PPY构建，前体OHA-PBA通过OHA与3-NH₂-PBA反应获得。图3（B-E）中各物质核磁特征峰及红外吸收峰的变化证实OHA-PBA及EC成功合成。图3（F-I）的SEM显示HE呈三维网络，而HEPP因PDA@PPY与PTPPG掺杂表面会更加粗糙。图3（J-K）结果显示在进行吸水实验时，HE及HEPP在快速吸液（前30 min）后趋于平衡，其中HEPP吸水略低于HE，但在干燥后保水相近。图3(L-N)结果分析可知，PTPPG在低pH、高H₂O₂及高葡萄糖条件下释放加速，而这主要归因于于希夫碱键在酸性环境中的质子化以及ROS的增加。图3O显示HEPP的压缩模量是HE的2.4倍，提示PDA@PPY和PTPPG的掺入增强了水凝胶的交联点，而这也在一定程度上为水凝胶提供一定的机械弹性和适应性。图3P显示HEPP在约85%应变时出现了凝胶点。图3Q显示在0.1–10 Hz的频率条件下下，HEPP和HE的储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），提示其具有良好的弹性，且HEPP的储存模量（G′）明显高于HE的，提示其具有良好的机械性能。图3R显示大应变条件下（250%），水凝胶的交联网络结构可被破坏，但在应变恢复到1%时，其G′和G″能迅速恢复到初始状态，提示水凝胶具有优异的自愈合能力。另外，由图3(S-T)可知，HEPP在体外对DPPH和ABTS自由基的清除率均达90%，提示其具有良好的抗氧化能力。该研究制备的HEPP整合了光/电/pH/ROS响应，具智能敷料应用前景。

图3. HEPP的合成与表征。A) HEPP合成流程示意图；B) OHA-PBA及C) EC的1H NMR谱；D) OHA-PBA及E) EC的FT-IR光谱； F- I) 不同放大倍数下HE和HEPP的SEM图像；J) HEPP和HE的吸水曲线；K) HEPP和HE的保水曲线；L) PTPPG在不同pH值、M) H2O2及N) Glu浓度下的释放速率；O) HE与HEPP的粘接强度；P) HE和HEPP在0.1 Hz频率下的应变响应流变行为分析。Q) 1%应变条件下HE和HEPP的频率响应流变特性；R)在低（1%）和高（250%）应变下对GHM水凝胶的应变试验；S) HEPP对DPPH 及T) ABTS的清除作用

（4）HEPP的体外抗菌活性

糖尿病患者的伤口更容易受到微生物感染，但巨噬细胞和中性粒细胞能够通过产生高水平的活性氧（ROS）来清除入侵的微生物。感染部位局部酸度的降低（由细菌的存在所引发）会导致在不同pH水平上断裂席夫碱键。释放出的PTPPG有助于分解谷氨酸，随后产生过氧化氢，并导致硼酸键的断裂。这一过程促进了 PTPPG 在伤口部位的积累，从而促进了与糖尿病相关的伤口中ROS的自我级联抗菌作用。图4A展示了HEPP会通过光触发而产生协同抗菌效果的作用机制，研究时选取革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌SA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）及革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌PA、多重耐药铜绿假单胞菌MDR-PA）作为代表性菌株进行评估。如图4B所示，经660 nm激光照射处理的样品组，其600 nm处吸光度较对照组显著降低，对上述四种细菌的抗菌率均高于75%。如图4C所示，在0.9 W下进行5 min的80 8nm激光照射后，细菌在600nm处的吸光度降低了约 93%。为了模拟由活性氧引发的伤口区域的抗菌反应，使用了 20 mM的Glu,随着HEPP 在PTPPG中的负载量增加，600 nm处OD值呈浓度依赖性下降。因此，图4D通过比较600 nm处的细菌存活率，验证了纳米酶在伤口部位自我级联抗菌活性的可能性。此外，图4E使用细菌活/死荧光染色来检测HEPP的综合光动力、光热和化学动力学抗菌特性。而通过图4F细菌菌落计数和定量荧光分析图表明，这三种疗法的组合显示出了最为显著的抗菌效果。如图4G所示，扫描电子显微镜图像显示，接受光动力疗法/光热疗法/光催化疗法处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和多重耐药肺炎链球菌（PDR-PA）的细菌出现了正常的细胞膜结构破坏以及破裂的迹象。综合来看，这些发现表明HEPP具有显著的抗菌特性，并在预防伤口处的细菌感染方面具有重要的应用潜力。

图4. HEPP的体外抗菌活性。A)抗菌活性的多种机制的示意图。B)用660 nm激光；C)808 nm激光及D）Glu处理或未处理5 min的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的OD 600 nm值；E）活/死染色细菌的荧光图像及F）在用不同条件处理后，在PBS（pH 7.4）中的SA、MRSA、PA和PDR-PA的相应定量统计分析结果；G）使用HEPP进行不同处理的细菌的SEM图像

（5）通过ES辅助的HEPP进行微环境和炎症调节

为了评估PTPPG、HEP和HEPP的生物相容性，对水凝胶进行了划痕测试，以评估其在体外促进成纤维细胞迁移的能力（图5A）。图5B显示，在培养24 h后，相比于对照组（20.6%），PTPPG 组（26.7%）、HEP 组（28.0%）和 HEPP 组（46.0%）显示出了优异的划痕愈合能力。在660 nm激光照射的条件下添加PTPPG会导致活性氧浓度显著增加。然而，经过4 h的处理后，与对照组相比，细胞内的ROS水平显著降低。此外，由图5C流式细胞术分析结果可知，纳米颗粒与光动力疗法的级联反应会导致RAW264.7 细胞中的ROS水平显著升高。而水凝胶的孵育可显著降低细胞中的ROS水平，这也有效避免了与ROS水平升高相关的潜在不良后果。如图5D所示，研究采用电刺激（0–1000 mV，步进250 mV）处理 RAW264.,巨噬细胞以探究 HEPP 在调控炎症微环境中的作用，由图5（E-H）的结果分析可知，当细胞同时接受HEPP和电刺激处理时，其从M1型表型向M2型表型的转变最为显著，这也表现在CD86的表达降低，而CD206的表达增加。为了验证 HEPP缓解伤口缺氧的能力，使用了细胞内缺氧指示剂Ru(dpp)来可视化人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）和NIH-3T3细胞的细胞氧合情况。如图5（I-J）所示，HUVEC和NIH-3T3细胞在没有材料处理的情况下均显示出明显的红色荧光，表明在缺氧处理后细胞的氧合水平相对较低。而相比于实验组，经过处理后细胞的荧光强度显著降低，这表明细胞氧合水平提高，这也进一步体现了HEPP缓解伤口缺氧的能力。为了进一步深入了解ES对细胞因子诱导的巨噬细胞极化的作用机制，我们采用定量逆转录聚合酶链反应（q-PCR）来研究信使RNA（mRNA）表达的变化。结果表明，TNF-α和IL-6的表达呈协同降低，而 IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）的表达则呈协同升高，如图5（K-N）所示。此外，用ES 和HEPP处理后，缺氧诱导因子（HIF-1α）的表达出现下调，这表明缺氧微环境得到了缓解（图5O）。

图5. 通过ES辅助的HEPP进行微环境和炎症调节。A) HUVEC的划痕显微图和B)不同处理后HUVEC迁移率的相应定量直方图；C)不同处理条件下RAW264.7细胞DCFH-DA荧光的流式细胞术结果；D) ES处理巨噬细胞调节炎症表型示意图；E）不同处理条件下RAW264.7细胞CD86及F）CD206表达的免疫荧光染色；G）RAW264.7细胞中CD86及H）CD206相对荧光强度的测定；I）Ru（dpp）对NIH-3T3和HUVEC细胞经不同材料处理后溶解O₂的荧光图像及J）相对荧光强度进行评价；K-O) qRT-PCR分析不同处理后RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10和HIF-1α对应的mRNA表达

（6）使用HEPP对ES辅助炎症调节的RNA测序分析

为了探究HEPP和ES在调节炎症过程中的作用，研究进行了RNA测序分析。实验对接受HEPP治疗、ES治疗以及两者联合治疗的各组RAW264.7细胞进行了分析，实验比较了M1极化（M1组）、ES组以及HEPP+ES的RAW264.7细胞的转录组差异。图6A结果表明，M1、ES和HEPP+ES组共同显示出 4238个差异表达基因。此外，ES组存在560个特异性差异表达基因，而HEPP+ES 组则包含749个特异性差异表达基因。图6B显示了M1和ES组之间表达显著变化的差异基因的分布情况。在ES处理后，共有115个显著基因表出现了表达变化，其中52个基因显示出显著增加，63个基因则显示出显著减少。而在使用HEPP与ES联合治疗后，共发现159个关键差异基因，其中57个基因的表达水平显著升高，而102个基因的表达水平则大幅降低（图6C）。图6D突出了M1组和HEPP+ES组之间特定基因活动的差异。红色表示基因活性增加，蓝色表示基因活性降低。为了确定治疗后与免疫反应相关的信号通路，分别对ES组和HEPP+ES组的差异表达基因进行了KEGG分析。如图6（E-F）所示，结果表明TNF和NF-κB信号通路存在显著差异，这些通路与 ES 组和 HEPP+ES 组中的炎症反应有关。如图6G所示，相比于M1组，ES组中TNF和IL-6 基因的表达更为明显，提示这两个基因在控制炎症反应方面的关键作用。图6H显示，与M1组相比，HEPP+ES组中TNF基因表达显著占优，且两组均显示NF-κB1基因表达上调。如图6（J-K）所示，相较于M1组，ES组和HEPP+ES组的TNF信号通路均显著下调；其中以HEPP+ ES组的下调幅度更大，表明该组中TNF通路受到更强的抑制。此外，图6（L-M）结果表明，NF-κB信号通路在ES组和HEPP+ES组中也呈现下调趋势。

图6. 使用HEPP对ES辅助炎症调节的RNA测序分析。A）韦恩图展示了M1、ES和 HEPP+ES组之间的差异基因计数；B-C）火山图分别展示了ES组与M1组以及HEPP+ES组与M1组之间的差异表达基因；D）M1组与ES+HEPP差异表达基因热图；E-F）EGG富集ES vs M1及HEPP+ES vs M1前20通路；G-H）TNF与NF-κB1通路差异基因PPI网络I）GO富集分析显示的前30条相关通路；J-M）GSEA 分析TNF和NF-κB通路

（7）HEPP对伤口的治疗效果

最后将HEPP应用于糖尿病小鼠伤口模型以评估它们在体内的抗菌、控炎及增强伤口愈合过程的疗效。图7A所示为糖尿病小鼠背部圆形创面模型的建立及给药流程图，图7B中小鼠空腹血糖≥16.7 mmol·L⁻¹被确定位模型成功构建，且小鼠伴随体重轻度下降（图7C）。在此基础上，图7D体外实验表明HEPP可迅速形成凝块，证实其具有快速止血性能。随后，借助808 nm激光对创面进行连续12 d的温度监测，结果显示HEPP组温升显著高于PBS对照，直接证明了PTPPG自敷料的可持续释放（图7E–F）。而后分析图7G-H的结果可知，7 d时HEPP单独处理组创面剩余面积仍达26.8%，与PBS组（34.7%）差异有限；相比之下，HEPP联合660 nm+808 nm激光与电刺激组创面仅余4.6%，至12 d几近完全愈合。在安全性评价方面，图7I实验结果表明1 mg mL⁻¹ PTPPG及HEPP的溶血率均低于5%，符合国际标准，提示其优异的生物相容性。

图7. HEPP对伤口的治疗效果。A）用于糖尿病伤口建立的小鼠模型创建示意图；B）建模及治疗过程中的血糖水平及C）体重水平；D）HEPP的止血特性；E）HEPP治疗过程中PTPPG释放的响应性光热成像；F）使用和未使用HEPP治疗的伤口温度变化；G）接受不同治疗的小鼠糖尿病伤口进展的图像；H）不同组别相对伤口面积的变化；I）不同材料的溶血实验

另外，实验通过组织化学染色和免疫荧光技术深入研究了其伤口愈合的机制。如图8A所示，HEPP＋660＋808＋ES组在术后第12天已重建完整表皮与真皮，并伴随显著的新生血管与毛囊生成；图8B的Masson染色进一步证实，该组胶原纤维致密且排列高度有序。在此基础上，图8C–E通过免疫荧光揭示，HEPP＋660＋808＋ES组的CD86表达最低而CD206表达最高，提示巨噬细胞由M1型向M2型有效极化；另外，由图8F–I定量结果可知，促炎因子TNF-α与IL-6显著下调，而抗炎因子IL-10与TGF-β显著上调，这些进一步证明了伤口部位炎症的显著缓解。图8J-K进一步利用VEGF与CD31双标记证实了HEPP＋660＋808＋ES组新生血管密度显著高于其余各组，而这种变化对于向代谢活跃的伤口供应必要的营养物质和氧气至关重要。

图8.染色法对伤口愈合机理研究。A）组织的H&E染色；B）组织的Masson染色；C）糖尿病伤口部位的组织切片中CD86、CD206、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、CD31和VEGF的免疫荧光分析；D-K）定量分析不同处理后的CD86、CD206、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、CD31和VEGF的平均荧光强度