研究背景：

针对上述问题，华东理工大学张隽佶团队构建了一种与血糖（BGL）实时互动的动态水凝胶敷料，用于解决糖尿病创面微环境复杂、血糖波动干扰愈合的难题。该水凝胶以碱性慢性创面环境为“燃料”，通过pH敏感的席夫碱交联和封装葡萄糖氧化酶（GOx）/过氧化氢酶（CAT），实现“溶胶-凝胶-溶胶”的循环：创面碱性环境触发水凝胶形成并封闭伤口；GOx消耗局部血糖生成葡萄糖酸，酸化微环境并切断席夫碱键使凝胶降解，释放的GOx进一步降低血糖；当血糖和pH趋于稳态时，凝胶降解和酶释放自动停止，从而维持创面微环境稳态。在I型糖尿病小鼠模型中，该自适应敷料显著加速创面愈合，展示了其作为下一代精准治疗材料的潜力。该文章于2025年7月1日以《Microenvironment-feedback regulated hydrogels as living wound healing materials》为题发表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-60858-3）。

图1. OSA-GEL@GC 水凝胶的制备及其对糖尿病伤口愈合的影响示意图

（1）微环境反馈调节水凝胶的设计与表征

微环境反馈调节水凝胶（OSA-GEL）是通过将氧化钠藻酸盐（OSA）与明胶（GEL）混合制备而成的。由于形成了亚胺席夫碱，生成了一种淡黄色凝胶，其特性通过流变学、傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行表征（图2 A）。由于亚胺键交联剂具有pH响应性，可在酸性环境中轻易解离，因此通过流变学测试检查了OSA-GEL的pH依赖性力学性能。该凝胶在高pH值下表现出良好的刚度（G’＝615 Pa，pH 8），而在低pH值下刚度显著降低（G’＝131 Pa，pH 5；图 2 B），表明pH值可调节水凝胶网络中的交联程度。与此同时，设计了一种催化且受pH反馈驱动的反应，与水凝胶系统耦合，利用葡萄糖氧化酶（GOx）通过消耗葡萄糖生成葡萄糖酸来自主调节局部pH值，最终导致水凝胶溶解。Gox 将葡萄糖转化为葡萄糖酸，体系pH随葡萄糖浓度(1–4 g/L)呈梯度下降至4.5–5.5，且GOx量(0.01–0.6 g/L)决定酸化速率（图2 C 和 D）。

通过在每个循环结束时重复添加碱性葡萄糖缓冲液，实现了三次暂态形成和解离循环。碱性燃料补充可触发凝胶—溶胶—凝胶三循环，溶胶段由葡萄糖浓度决定（图2 E 和 F），为了了解动态过程中的形态变化，对第二个循环的样品进行了扫描电子显微镜（SEM）成像，并在不同时间间隔进行分析（图2 G）。通过燃料/反燃料循环获得了“膨胀-收缩-膨胀”过程（图2 H），这与OSA-GEL@G的瞬态形成和解离过程一致。OSA:GEL=1:2时黏附强度最高达6.0 kPa，可随皮肤弯曲、拉伸、扭转保持贴合（图2 I–K）。动态溶胀-收缩循环证实凝胶可逆性，水凝胶模制性能良好，可在不同形状创面原位成型。

图2.（A）OSA-GEL水凝胶及其前驱体OSA与明胶的红外光谱及凝胶制备示意图；（B）OSA-GEL@G水凝胶在pH 8与pH 5下的流变特性；（C、D）不同葡萄糖/GOx浓度驱动的可编程pH变化（n=3）；（E）以碱性缓冲液为燃料的三次溶胶-凝胶循环流变曲线；（F）燃料-反馈环路内的形成-解离示意图；（G、H）0.6 g/L GOx与4 g/L葡萄糖体系中不同时间点的SEM图像（比例尺10 μm）及孔径分析（n=3）；（I、J、K）水凝胶与皮肤组织的黏附行为示意图、剪切强度测试以及不同OSA:GEL比例下的黏附力（n=3）及其在小鼠皮肤上随形变保持黏附的照片（比例尺1 cm）

（2）OSA-GEL@GC 水凝胶的体外生物相容性

为了制备动态伤口敷料，进一步引入过氧化氢酶（CAT）与GOx结合，OSA-GEL@GC以0.60 g/L GOx与0.08 g/L CAT共封装，CAT将GOx催化葡萄糖生成的H₂O₂实时转化为H₂O与O₂，不仅降低了活性氧（ROS）的毒性，还缓解了糖尿病伤口缺氧的微环境。为了评估OSA-GEL@GC的生物相容性，体系与HUVECs共培养5 d，活/死染色未见死细胞增多，CCK-8示细胞存活率与空白对照一致（图3 A 和 B）。溶血试验显示，PBS阴性对照组和凝胶组未出现显著颜色变化（＜5%；图3 C），显著低于双蒸水阳性对照，表明OSA-GEL@GC具有良好的血液相容性。3D Transwell实验24 h后，凝胶组穿过膜细胞数与对照无统计学差异（图3 D 和 E）。在划痕实验中，2D划痕实验24 h后，凝胶组剩余创面面积较对照缩小20%（图3 F 和 G），表明凝胶甚至能在一定程度上改善细胞的2D迁移能力。上述结果进一步证实了OSA-GEL@GC良好的生物相容性及其作为伤口敷料的潜力。

DCF 荧光探针检测显示，含CAT 组（Group 3）胞内 ROS 荧光强度显著低于未加 CAT组（Group 2）（图3 H 和 I），表明过氧化氢酶组分具有有效的 ROS 清除作用。细胞内O₂探针成像及溶氧仪测定表明，Group 3荧光信号弱于Group 2，溶解氧浓度由4.2 mg/L升至7.8 mg/L，而对照组下降至2.1 mg/L（图3 J 和 K），表明过氧化氢酶组分有效诱导了 O₂ 生成。这些结果表明，过氧化氢酶（CAT）能够将 ROS转化为H2O 和O2，从而缓解糖尿病伤口的缺氧状态。

图3.（A）HUVECs共培养第1、3天活/死染色（标尺50 μm）；（B）第1、3、5天细胞存活率（n=3）；（C）溶血率测试：双蒸水、PBS、凝胶组（n=3）；（D）Transwell迁移图像（标尺50 μm）；（E）迁移统计（n=3）；（F）划痕0、12、24 h图像（标尺50 μm）；（G）划痕迁移定量（n=3）；（H、I）DCFH-DA测胞内ROS（标尺50 μm，n=5）；（J、K） Ru(dpp)₃Cl₂测胞内O₂（标尺50 μm，n=5，组1：细胞；组2：OSA-GEL@G；组3：OSA-GEL@GC）

（3）用于体内糖尿病伤口愈合的 OSA-GEL@GC 水凝胶敷料

为了反映燃料反馈设计对伤口微环境稳态的影响，监测了糖尿病小鼠伤口微环境中的葡萄糖含量、pH值以及水凝胶状态。用 OSA-GEL 对照组处理的第 2 组的葡萄糖含量相对较高，在 0.86-1.23 mmol/g 之间。相比之下，用 OSA-GEL@GC 处理的第 3 组的葡萄糖含量在最初的 12 小时内从最初的 1.19 mmol/g 急剧下降到 0.60 mmol/g，然后在随后的 36 小时内逐渐下降到约 0.25 mmol/g，并在接下来的 3 天内几乎保持不变，没有持续下降，显示出良好的 BGL 降级和同化作用（图 4 A）。伤口床的pH值也进行了检测，结果最终稳定在6.5±0.2左右（图 4 B）。伤口 pH 值呈弱酸性，有利于伤口修复，这种 “平衡 ”状态一直持续到第 5 天。pH值的平衡可归因于碱性pH值和生理缓冲液作为调节pH值的燃料。而对照组（用 OSA-GEL 处理的第 2 组）的伤口 BGL 和 pH 值在 5 天后仍保持在较高水平，显示伤口愈合效果相对较差。在 OSA-GEL 敷料组的初始阶段，糖尿病伤口的基本微环境可能会导致测试伤口床的 pH 值（约 7.8）和 BGL 值（1.24 mmol/g）升高，这是糖尿病伤口微环境的典型特征。BGL（0.99 mmol/g）和pH值（约7.5）在36小时后略有下降，相比之下，OSA-GEL@GC在12小时后显著下调了伤口床的pH值（约6.6）和BGL水平（0.60 mmol/g）。上述结果表明，通过OSA-GEL@GC敷料治疗可能改善微环境，从而促进糖尿病伤口愈合。

小鼠的伤口愈合过程（图4 C 和 D）结果显示，第3组（OSA-GEL@GC）的伤口愈合情况优于其他糖尿病组（1和2）。第21天背部伤口的示意图显示，第3组（OSA-GEL@GC）的伤口愈合加速，因其相对伤口面积仅约4.51%（1.28 mm²）。使用Tegaderm™（第1组）和OSA-GEL（第2组）治疗的糖尿病组显示出有限的愈合效果，分别为7.86 mm²（27.79%，第1组）和4.97 mm²（17.58%，第2组）。供能（基本伤口微环境）与抗供能（葡萄糖酸）循环导致OSA-GEL@GC敷料随时间推移逐渐脱落，从而实现无损伤的敷料更换。HE染色结果表明使用OSA-GEL@GC（组3）处理的伤口基本愈合，并形成连续的上皮组织，与正常小鼠对照组组4相似。第3组的平均伤口直径为1.03毫米，对照组1和2的上皮化水平仍较慢，平均伤口直径分别为3.15毫米和2.51毫米（图4 E）。组3的平均组织胶原含量为15.3%（图4 F），高于组1（7.5%）和组2（12.4%）。Masson三色染色和Sirius红染色均显示，OSA-GEL@GC组（组3）和正常小鼠组（组4）的真皮层胶原沉积更密集且排列更规整，在伤口愈合的成熟阶段，I型与III型胶原的比率会增加，Sirius红染色结果显示，组3的I型/III型胶原蛋白比例（1.46）高于组1（1.17）和组2（1.29）（图4 G 和 H）。这些结果表明，OSA-GEL@GC敷料可通过加速上皮化水平和胶原蛋白沉积促进伤口愈合。

图4.（A）5 d内创面血糖（方块：OSA-GEL@GC；圆圈：OSA-GEL，n=3）；（B） 对应pH值（n=3）；（C）第0、7、14、21天创面照片；（D）第0、7、14、21天相对创面面积（n=3）；（E–G）第21天创面直径、胶原体积分数、胶原I/III比值（n=3）；（H）第21天H&E（行1-2）、Masson（行3）、Sirius红（行4）染色图，标尺依次为200、100、100、100 μm

（4）OSA-GEL@GC 水凝胶促进伤口愈合的特性分析

管形成实验测试了OSA-GEL@GC敷料的血管生成促进能力。结果显示，与对照组相比，OSA-GEL@GC组处理的HUVECs在6小时的时间间隔内表现出显著的管形成能力（图 5 A-C）。CD31是血管内皮细胞的标志物，其表达与血管生成的程度呈正相关。体内实验结果，第3组在第7天时CD31的阳性面积显著高于其他糖尿病对照组1和2（图5 D 和 E），表明OSA-GEL@GC可能对新生血管形成具有促进作用。

在伤口愈合的早期阶段，真皮中的肌纤维化与伤口愈合的有效性相关。与组1和组2相比，组3（第7天）中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞的数量增加，表明肌成纤维细胞的面积有所增加（图5 F 和 G）。肌成纤维细胞在伤口修复的早期和晚期阶段具有不同的贡献，在伤口修复的早期阶段，肌成纤维细胞从成纤维细胞转化为合成胶原蛋白并产生增强的收缩力，导致更坚硬的细胞外基质（ECM），能够抵抗外部压力，有利于伤口收缩和愈合。而在晚期阶段，肌成纤维细胞的长期存在导致胶原蛋白过度合成，最终导致增生性疤痕形成。肌成纤维细胞的凋亡可防止过度纤维化并促进成熟的瘢痕重塑。第3组在第7天与第1、2组相比，α-SMA阳性肌成纤维细胞数量更高，但在第21天则更低。这两项观察结果表明，接受OSA-GEL@GC治疗的第3组在伤口愈合过程中进展更快，优于第1组和第2组。这明确证明了OSA-GEL@GC凝胶敷料在促进伤口血管生成和早期收缩方面具有更优越的能力。

图5.（A）HUVECs管腔形成图（标尺50 μm）；（B、C）节点数及总分支长度统计（n=5）；（D）第7天CD31染色图（标尺100 μm）；（E）CD31阳性面积百分比（n=5）；（F）第7天α-SMA染色图（标尺100 μm）；（G）α-SMA阳性细胞计数（n=5）

（5）OSA-GEL@GC水凝胶对伤口愈合的炎症分析

通过清除活性氧（ROS）改善炎症微环境，并促进巨噬细胞从M1型向M2型转变，有助于促进有效的伤口愈合。流式细胞术结果显示，高葡萄糖DMEM显著促进了M1极化（凝胶组CD86阳性率为12.13%，对照组为17.92%）。而CD163阳性率（M2转化的标志）在凝胶组（5.27%）高于对照组（3.10%），表明OSA-GEL@GC可能具有减轻炎症的活性作用。ROS荧光染色结果显示ROS水平从第一组到第四组呈下降趋势（图6 A）。M1（CD86阳性细胞）和M2（CD163阳性细胞）巨噬细胞的免疫荧光共染色结果显示，组3（OSA-GEL@GC）中向M1极化的程度显著降低，而组1和2中该比例仍保持在较高水平（图6 B）。伤口组织中促炎因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（Tnf）在第1组中的表达水平最高，而在其他组中保持在低水平。此外，抗炎因子IL-10在第3组中的表达水平略高于第1组和第2组（图6 C-E）。这些结果表明，OSA-GEL@GC能有效减少活性氧（ROS）的产生并抑制巨噬细胞向M1表型极化，从而抑制炎症反应并加速愈合过程。

图6.（A）第7天ROS染色图像（标尺100 μm）及荧光强度统计（n=5）；（B）第7天M1（CD86⁺）/M2（CD163⁺）共染图像（标尺100 μm）及M1/(M1+M2)比值（n=5）；（C–E）四组创面IL-6、Tnf、IL-10 mRNA表达（n=3）

（6）OSA-GEL@GC水凝胶处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的RNA测序分析

高葡萄糖DMEM组（对照组）与OSA-GEL@GC组的转录组谱通过差异表达分析、基因本体论（GO）富集分析及基因集富集分析（GSEA）进行分析。两组间的转录差异通过主成分分析（PCA）得以揭示（图7 A）。火山图展示了两组间差异表达基因（DEGs）的分布，其中包含65个上调基因和40个下调基因（图7 B）。在Venn图中，OSA-GEL@GC组与对照组相比具有180个独特基因（图7 C）。热图展示了两组间105个DEGs的表达谱（图7 D）。差异表达基因的主要生物学过程与血管重塑相关，表明浸润DMEM的凝胶对HUVEC管形成有益（图7E和F）。通过GSEA分析相关信号通路，与肾小球血管发育相关的关键基因在OSA-GEL@GC组中显著上调（图7 G）。在差异表达基因中，多个与促进HUVEC管形成相关的基因在OSA-GEL@GC组中显著上调（图6 H）。OSA-GEL@GC组中Activin A受体2B 型（ACVR2B）的上调可激活下游Smad2/3通路，从而促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移和管状结构形成。CD177与作为血管内皮细胞表面CD31的异源体蛋白酶3（PR3）结合，可诱导HUVECs中血红素氧合酶-1的表达并促进抗氧化细胞反应。OSA-GEL@GC组中血小板衍生生长因子受体β的上调表明内皮细胞对血小板衍生生长因子的敏感性增加，这有利于血管生成。内皮细胞中的Notch配体Jagged1被识别为血管形成的关键因素。微RNA-221的高表达可上调AKT/eNOS通路并抑制内皮细胞中homeodomain相互作用蛋白激酶2的表达，从而促进血管生成。因此，上述OSA-GEL@GC组中显著表达的基因有助于新生血管的形成，并积极促进伤口愈合。

图7.（A）对照与OSA-GEL@GC组基因表达PCA图；（B）DEG火山图（DESeq2，Wald双侧）；（C）DEG数量Venn图；（D）DEG热图；（E、F）GO富集：血管重塑主导（ClusterProfiler，单侧BH校正）；（G） GSEA富集肾小球血管发育通路；（H）上调基因关联管腔形成与血管生成