针对上述问题，重庆大学的罗忠等团队设计了一种基于水凝胶的生物活性合成皮肤（HBSS），该敷料材料由生物相容性组分构成，用于烧伤创面的治疗，能够在局部介导硫化氢（H2S）的释放，以刺激组织再生，同时抑制细菌感染和过度炎症反应。具体而言，H2S供体——N-(苯甲酰巯基)苯甲酰胺首先与巯基酮（TK）连接的多巴胺二聚体共同组装形成纳米结构（DDNs），随后将其整合进以希夫碱为交联方式的透明质酸-羧甲基壳聚糖水凝胶中。在烧伤创面中升高的酸性环境可诱导水凝胶降解，释放出DDNs；随后，在活性氧（ROS）诱导下，TK连接键断裂，释放出H2S气体，同时以自我消耗方式降低局部ROS应激水平。该过程可通过激活AMPK与RAS-MAPK-AP1等促愈合信号通路，促进局部血管生成和组织再生，同时通过激活ERK1/2与NRF2信号通路，实现巨噬细胞由M1型向M2型的免疫重编程。此外，水凝胶网络中的壳聚糖组分可有效抑制创面部位的细菌定植，从而防止局部感染。这些特性协同作用，实现了快速而稳健的烧伤创面愈合，为临床烧伤治疗提供了一种新的思路和策略。该文章于2025年4月10日以《Hydrogel-Based Bioactive Synthetic Skin Stimulates Regenerative Gas Signaling and Eliminates Interfacial Pathogens to Promote Burn Wound Healing》为题发表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c01134）。

研究示意图

(1) DDNs和HBSS的制备与表征

透射电子显微镜（TEM）分析显示，生成的DDNs具有均匀的球形形态和高单分散性（图1A）。动态光散射（DLS）分析表明，NSHD的加入使纳米粒子的尺寸从200 ± 5 nm略微增加至220 ± 7 nm，但对纳米粒子的单分散性没有明显影响（图1B）。ζ电位分析显示，DDNs的表面电荷约为−33.1 mV，与原始PDA纳米粒子的电荷（约−31.2 mV）相当（图1C）。能量色散X射线谱（EDS）结果表明，硫信号均匀分布在纳米粒子中，证实了NSHD成功加载到PDA基体中（图1D）。通过紫外吸收法的定量分析，NSHD在最终纳米粒子中的加载比率约为11.2%。这些数据共同确认了DDNs的高均一性和NSHD加载的简便合成。本研究中使用的HBSS是通过透明质酸（HA）和羧甲基壳聚糖（CMC）在希夫碱交联作用下合成的。研究人员观察到，OHA与CMC混合后5分钟内即形成水凝胶（图1E）。扫描电子显微镜（SEM）成像显示，OHA-CMC水凝胶具有高度多孔和互联的网络结构，典型的水凝胶生物材料特性，提供了丰富的空间用于DDN的负载（图1F）。环境扫描电子显微镜（ESEM）结果显示，DDNs能够轻松地结合到OHA-CMC水凝胶基体中，最终纳米粒子负载量约为85%（图1G）。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析验证了通过希夫碱交联形成水凝胶，并成功集成了DDNs（图1H）。

图1.（A）DDN的TEM图像。（B）通过DLS测量的DDN的粒度和分布。(C)DDN的Zeta电位。（D）DDN的EDS结果。（E）水凝胶形成过程的照片说明。（F）生成的水凝胶的SEM图像。（G）HBSS样品的SEM图像。（H）HA、OHA、CMC、OHA-CMC和HBSS的FTIR光谱

（2）HBSS的力学性能、药物释放、抗氧化能力和抗菌性能

皮肤组织常受机械应力影响，这对烧伤创面敷料的机械稳定性构成挑战。研究人员通过分析HBSS的压缩和膨胀性能，研究了其在烧伤创面环境中的稳定性。在OHA:CMC比例为3:1时，OHA-CMC水凝胶和HBSS的膨胀率分别为278%和267%（图2A），有助于排出创面渗出液并保持湿润环境，且HBSS的抗压强度达到97.4 KPa（图2B）。流变学测试表明，HBSS具有较高的储能模量，适合作为烧伤创面敷料（图2C）。HBSS在模拟烧伤创面渗出液中（500 μM H2O2，pH 6.5）孵育后，显示出良好的降解性能，7天内完全降解，剩余重量降至20%（图2D, 2E）。DDNs在相同条件下处理2天后，TEM显示其平均水动力学尺寸减少至120 ± 5 nm（图2F），支持HBSS在创面环境中的降解释放治疗性载荷。H2S生成测试表明，酸性环境和H2O2能促进HBSS释放H2S，4天后H2S释放量达到32.5 μM（图2G）。此外，DDNs具有显著的抗氧化效果，能够清除DPPH（图2H, 2I），进一步证实HBSS能够有效清除创面过量ROS，促进创面修复。研究人员测试了CMC整合的HBSS对常见烧伤创面感染病原菌（铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）的抗菌效果。结果显示，HBSS组的杀菌效率分别为60.3%、59.3%和67.8%，高于OHA-CMC组（图2J−K）。细菌处理后的扫描电镜（SEM）图像显示，细菌壁塌陷，证实了HBSS通过壳聚糖的抗菌作用有效消除附着细菌，防止创面感染（图2L）。

图2.（A）具有不同组成的水凝胶基样品的溶胀特性。（B）具有不同组成的水凝胶基样品的压缩性能。（C）HBSS和OHA-CMC样品之间生物力学性能的比较分析。（D）水凝胶基样品随时间降解的照片说明。（E）水凝胶基样品的降解率。（F）H2O2引发降解前后DDN尺寸的比较。（G）不同条件下HBSS随时间的H2S释放曲线。（H）不同浓度下DDN的DPPH清除能力。（I）无DDN的OHA-CMC水凝胶和HBSS的DPPH清除能力。（K）不同水凝胶基样品的抗菌活性的统计分析。（L）不同处理后金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的SEM图像

（3）HBSS的体外生物相容性

为了研究HBSS在临床相关条件下的安全性，研究人员首先通过CCK-8法在跨腔培养系统中测试了其对皮肤细胞群体的生物相容性（图3A），其中水凝胶放置在上室，细胞接种在下室。测试的细胞系包括HUVECs、L929s和RAW 264.7。结果表明，HUVECs、L929s和RAW 264.7细胞在与HBSS孵育3天后，细胞活力未出现明显下降（图3B、C）。这些结果也通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步验证（图3E）。这些观察结果表明，由于选用了生物相容性生物聚合物成分，HBSS无毒。为确保足够的ROS清除效果，使用ROS反应性荧光探针DCFH-DA进行的荧光成像显示，HBSS处理能有效清除细胞内的ROS（图3D），再次验证了HBSS衍生的巯基化多巴胺单元对ROS清除的贡献（图3F）。有趣的是，WB分析显示，HBSS处理显著激活了巨噬细胞群体中的Nrf2信号通路（图3G−I），这是一种在活细胞中已知的抗氧化机制，可能有助于清除烧伤创面引发的皮肤细胞中的ROS。Nrf2和血红素加氧酶-1（HO-1）的相对表达分别比对照组高出108%和92%。总体而言，HBSS能够高效减轻生物环境中的ROS应激，且具有较高的安全性，能够促进细胞增殖。

图3.（A）transwell共培养系统示意图。（B）与不同样品孵育3天后的L929存活率（。（C）与不同样品孵育3天后的HUVEC存活率。（D）响应于不同处理的L929细胞和HUVEC中ROS的相对含量。（E）显示不同处理后L929细胞和HUVEC增殖的荧光图像（（F）不同样品减轻皮肤相关细胞中氧化应激的能力。（G）用不同样品处理后巨噬细胞中Nrf 2和HO-1蛋白的表达水平。（H）不同处理后巨噬细胞中Nrf 2蛋白的相对表达。（I）HO-1蛋白的相对表达。处理组的设置：NaSH、对照（PBS）、OHA-CMC水凝胶、水凝胶-PDA NP复合物（HPN）和负载NSHD的水凝胶（HN）组

图4. (A)不同处理后L929 s、HUVECs和RAW 264.7细胞中的H2S水平。（B）HUVECs的管形成效率。（C）血管分支数目的统计分析。（D）不同处理后血管长度的统计分析。（E）AMPK、p-AMPK、TXNIP、（F）不同处理后L929细胞的迁移能力。（G）不同处理后L929细胞中MEK 1、AP-1和RAS蛋白的表达

（5）HBSS的抗炎作用

为研究HBSS是否通过改变巨噬细胞组成来逆转SBW的炎症状态，研究人员首先用LPS诱导RAW 264.7细胞转变为M1表型，并监测其形态学变化。LPS处理后的RAW 264.7细胞表现为椭圆形和突触形态，且iNOS表达显著上调，表明成功诱导为促炎M1型表型。与此相比，HBSS处理后的LPS诱导RAW 264.7细胞表现出从变形虫形态到梭形形态的显著变化，天线形成减少（图5A），并伴随M2特征标记物CD206的上调。免疫荧光分析显示，HBSS处理的巨噬细胞iNOS表达降低，而CD206表达增加（图5B）。在巨噬细胞表型变化的基础上，研究人员进一步通过ELISA测试评估了培养体系中的细胞因子分泌情况。LPS诱导显著降低抗炎细胞因子IL-4和IL-10的分泌，同时增加了促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的分泌，表明巨噬细胞的促炎潜力增强。与此不同，HBSS处理LPS诱导的RAW 264.7细胞显著增加了IL-4和IL-10的分泌，同时减少了IL-1β和TNF-α的分泌（图5C−F）。这些趋势与q-PCR分析中相关细胞因子mRNA水平的结果一致，表明HBSS能够将M1型巨噬细胞重新编程为M2型表型，从而抑制过度的炎症反应（图5G−J）。进一步分析HBSS处理后巨噬细胞的生化变化，证实了多巴胺单体和H₂S通过清除创面微环境中的ROS，能够阻断相关的促炎信号事件，从而减轻局部炎症。WB分析显示，HBSS处理显著激活了MAPK-Erk1/2-p38信号通路，这与H₂S的抗炎作用一致（图5K−M）。因此，这些作用协同介导了M1型巨噬细胞向M2型的高效重编程，并抑制了下游的炎症反应。

图5. (A)各种处理后LPS诱导的巨噬细胞的形态学变化。（B）用样品处理后LPS诱导的巨噬细胞中CD 206和iNOS的表达。（C-F）用不同样品处理后不同巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平。（G-J）用不同样品处理后不同巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的表达。（K）WB检测不同样品处理后巨噬细胞中p-p38和p-Erk 1/2蛋白的表达;（L）不同样品处理后巨噬细胞中p-Erk 1/2蛋白的相对表达;（M）不同样品处理后巨噬细胞中p-Erk 1/2蛋白的相对表达。p38的表达

（6）HBSS在体内的SBW治疗功效

研究人员在背部带有1 cm²圆形感染性三度烧伤创面的小鼠模型上全面研究了HBSS治疗对烧伤创面（SBW）愈合的促进作用（图6A）。HBSS治疗显著减少了创面面积，治疗14天后创面几乎完全愈合，表面形成小结痂，并无感染迹象（图6B）。相比之下，控制组和OHA-CMC组在第14天创面明显较大，创面处有可见渗出液，表明感染性SBW的愈合不足。定量分析显示，HBSS组的最终创面面积最小，比治疗组的对照组小35%（图6C）。通过HE染色和Masson三色染色进一步分析了不同治疗组的SBW愈合情况，在治疗7天时，HBSS组显著提高了创面区域的上皮覆盖度，并部分再生了受损的毛囊（图6E）。到治疗第14天，HBSS组创面几乎完全愈合，创面上皮完全重建。Masson染色结果显示，HBSS组的胶原沉积优于其他所有组，几乎与健康皮肤组织相当（图6F）。另外，研究人员通过免疫荧光染色CD31和Ki67检测了创面组织的血管化，表明创面再生的强度（图7A）。HBSS组的毛细血管密度是对照组的1.9倍，明显高于其他处理组（图7B、C），表明创面区域的血管系统成功恢复，促进了适当的伤口愈合。WB分析显示，HBSS处理显著激活了AMPK和AP1信号通路（图6D），这一结果与体外数据一致，支持了提出的伤口愈合机制。这些数据表明，HBSS可以高效加速感染性SBW的愈合，且具有较高的安全性。

图6.（A）实验方案的示意图。（B）显示从第0天到第14天的各种治疗后建立的SBW伤口的时间依赖性愈合的代表性照片。（C）从第0天到第14天的不同治疗后伤口面积的定量分析。比例尺：（D）不同处理后小鼠中关键蛋白介质表达的WB测定。（E，F）第7天和第14天伤口组织的代表性（E）H&E和（F）Masson染色图像

（7）HBSS介导的体内巨噬细胞重编程

研究人员进一步分析了烧伤创面（SBW）部位的巨噬细胞组成，以阐明愈合机制。结果显示，控制组的SBW组织在治疗7天后表现出高水平的iNOS和低水平的CD206，表明创面仍受到严重炎症的影响。相比之下，HBSS治疗显著上调了CD206的表达，同时降低了iNOS的表达（图7D、E）。具体而言，HBSS组CD206的水平比未处理的对照组高1.92倍，而iNOS水平降低了62.14%（图7F、G），表明HBSS治疗能够有效地将巨噬细胞从促炎M1表型重编程为抗炎M2表型，有助于缓解SBW部位的过度炎症反应。同时，通过PCR检测创面组织中与炎症相关的细胞因子的mRNA水平，结果发现HBSS治疗显著下调了TNF-α和IL-1β的mRNA表达，同时恢复了IL-4和IL-10的mRNA表达，其细胞丰度与健康皮肤组织相当（图7H−K）。此外，创面组织的生化分析显示，HBSS显著激活了NRF-2和ERK1/2信号通路，有效抑制了过度的炎症反应（图7L−O）。综上所述，HBSS能够通过减轻巨噬细胞介导的慢性炎症反应，促进SBW的愈合。

图7.(A)治疗14天后伤口的CD 31和Ki 67免疫染色。（B）CD 31表达的统计。（C）Ki 67表达的统计。（D）治疗14天后伤口中CD 206表达的免疫染色。(E)治疗14天后伤口中的iNOS免疫染色。（F）CD 206表达的统计。（G）iNOS表达的统计分析（细胞核用DAPI（蓝色）标记）。（H−K）正常小鼠皮肤和不同实验组TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的相对表达，（L）WB检测不同处理后小鼠p-Erk 1/2和p-p38蛋白的表达。(M)不同处理后小鼠中Nrf 2和HO-1蛋白的WB测定。（N-O）图L和M中蛋白表达的统计学