IF：18.5 《AFM》吉大徐彩娜/厦门理工李艳辉：广谱协同抗菌纳米颗粒用于伤口愈合和肺部感染治疗

针对上述问题，厦门理工大学李艳辉教授和吉林大学徐彩娜教授等人提出了开发一种多功能协同抗菌纳米粒子（MPH NPs）的策略。该纳米粒子通过将抗菌肽多粘菌素B（PMB）负载于Fe基MOF（MIL-100）上，并进行透明质酸（HA）修饰，实现了通过化学动力学治疗（CDT）和PMB释放的双重抗菌效果。该文章于2024年6月10日以《Synergetic Antibacterial Nanoparticles with Broad-Spectrum for Wound Healing and Lung Infection Therapy》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202403188）。

MPH NPs的合成及抗菌应用示意图

（1）MPH NPs的合成与表征

MPH NPs的制备过程如图1所示。首先，通过微波辅助法合成MIL-100NPs，并将PMB加载到MIL-100NPs中制备MP NPs，FT-IR和XPS结果显示PMB成功负载（图1A-F）。随后，用HA修饰MP NPs，得到MPH NPs。通过控制MIL-100NPs与PMB的比例，优化药物负载量，最终选择1:2的比例进行研究（图1G）。MPH NPs的粒径约为203.4±5.1 nm，zeta电位约为-17.2±1.1 mV，表现出良好的分散性和稳定性（图1H-J）。在模拟细菌生长环境的研究中，MPH NPs在HA酶和酸性条件下表现出双响应释放特性，释放效率显著提高（图1K-L）。

图1. MPH NPs 的表征。（A）MIL-100纳米颗粒、PMB、MP纳米颗粒、HA及MPH纳米颗粒的FT-IR光谱；（B）MIL-100纳米颗粒、MP纳米颗粒及MPH纳米颗粒的XPS光谱；（C）MPH纳米颗粒的XPS分析：Fe 2p峰；（D）C 1s峰；（E）O 1s峰；（F）N 1s峰；（G）不同重量比MIL-100纳米颗粒与PMB的MP纳米颗粒的药物加载量；（H）MIL-100纳米颗粒、MP纳米颗粒及不同MP纳米颗粒与HA重量比的MPH1-3纳米颗粒的粒径；（I）MP纳米颗粒与HA重量比为1:1时，MIL-100纳米颗粒、MP纳米颗粒及MPH纳米颗粒的ζ电位；（J）MIL-100、MP纳米颗粒及MPH1-3纳米颗粒在ddH₂O中24小时后的稳定性图像；（K）MPH纳米颗粒在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4和5.5）和细胞培养基中的尺寸稳定性（n=3）；（L）在有或无HAase的情况下，PMB在磷酸盐缓冲液（pH 7.4或5.5）中的释放情况（n=3）

（2）羟基自由基（•OH）的产生和谷胱甘肽（GSH）的消耗

MPH NPs能够催化过氧化氢（H₂O₂）生成以•OH为主的活性氧（ROS），并通过电子顺磁共振（EPR）谱图验证其产生（图2A）。通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色反应和亚甲基蓝（MB）降解实验进一步确认了MPH NPs生成•OH的能力，且酸性环境（pH 5.5）下•OH的生成量显著增加（图2B-E）。此外，MPH NPs能够消耗GSH（图2F,G），降低细菌的抗氧化防御能力，从而增强抗菌效果。细胞内ROS水平实验表明，MPH NPs在H₂O₂存在下能够显著增加RAW 264.7细胞内的ROS水平，进一步验证了其产生ROS的能力（图2H,I）。

图2. MPH纳米颗粒的ROS生成和GSH消耗能力。（A）MPH纳米颗粒/H₂O₂体系中DMPO-•OH和DMPO-•O₂⁻的电子顺磁共振（EPR）谱图；（B）TMB显色反应结果；（C）MPH纳米颗粒在不同pH值下产生•OH的催化能力；（D）不同浓度MPH纳米颗粒降解亚甲蓝（MB）的实验结果；（E）•OH生成速率与H₂O₂浓度之间的米氏-门特恩（Michaelis-Menten）曲线（pH 5.5，n=3）；（F）与不同浓度MPH纳米颗粒孵育后GSH的消耗情况；（G）L929细胞经不同浓度MPH纳米颗粒处理后GSH的消耗情况；（H）RAW 264.7细胞经各组预处理12小时后细胞内ROS水平的荧光显微镜图像；（I）细胞内ROS的荧光强度统计

（3）MPH NPs的体外抗菌试验

MPH NPs对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌S. aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌效果通过细菌平板计数法进行评估。结果显示，MPH NPs在H₂O₂存在下，通过CDT和PMB释放的协同作用，对S. aureus和MRSA表现出显著的抗菌效果，尤其在酸性环境（pH 5.5）下几乎完全杀灭这些细菌。相比之下，单独的PMB、MIL-100NPs或H₂O₂处理组的抗菌效果较差（图3A-F）。

图3. MPH纳米颗粒的抗菌活性。（A）接种细菌的菌落照片（上图：金黄色葡萄球菌；下图：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA））；（B）相应的细菌存活率；（C）不同条件下处理的金黄色葡萄球菌的荧光图像；（D）不同条件下处理的MRSA的荧光图像；（E）不同条件下处理的金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜（SEM）图像；（F）不同条件下处理的MRSA的扫描电子显微镜（SEM）图像

（4）MPH NPs在皮肤伤口感染中的抗菌效果

为了进一步评估MPH NPs在伤口愈合中的抗菌效果，研究构建了小鼠皮肤伤口感染模型（图4A），并分别用含有PBS、PMB、MIL-100NPs和MPH NPs的Carbomer 940凝胶处理感染伤口。结果显示（图4B,C），MPH NPs治疗组的小鼠伤口愈合速度显著快于其他组，且细菌负载量最低（图4F）。组织病理学分析表明（图4E），MPH NPs处理组伤口的炎症细胞数量显著减少，胶原沉积有序，血管生成和上皮结构恢复良好。此外，MPH NPs处理组小鼠的体重变化也相对稳定（图4D），未出现明显毒性反应。

图4. 金黄色葡萄球菌对伤口愈合的治疗作用。（A）伤口愈合模型治疗方案示意图；（B）第0、2、4、6、8天小鼠伤口区域的照片；（C）小鼠的相对伤口面积；（D）小鼠体重的相应变化；（E）8天后各种治疗后伤口组织的H&E和Masson染色图像，箭头指示胶原沉积和新生毛囊；（F）从伤口组织获得的细菌菌落的照片及活细菌的定量分析

（5）MPH NPs的体外细胞摄取和体内肺部靶向性

研究表明，MPH NPs能够通过HA与细胞表面CD44受体的相互作用，实现特异性细胞摄取。在体外实验中，MPH NPs对表达CD44的RAW264.7细胞的摄取显著高于不表达CD44的NIH3T3细胞（图5A,B）。此外，体内实验表明，MPH NPs在肺部感染小鼠模型中，能够特异性靶向感染部位，并在肺部长时间积累，有效发挥抗菌作用（图5C-E）。

图5. MPH纳米颗粒的细胞摄取和靶向能力。（A）流式细胞术检测CD44阴性NIH 3T3细胞和CD44阳性RAW 264.7细胞对游离Cy5、Cy5标记的MP纳米颗粒、MPH纳米颗粒以及HA+MPH纳米颗粒的体外细胞摄取；（B）用PBS、游离RB、RB标记的MP纳米颗粒和MPH纳米颗粒以及MPH纳米颗粒+HA处理12小时的RAW 264.7细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像；（C）肺部感染模型体内药物靶向实验方案；（D）不同时间点用游离Cy5、Cy5标记的MP纳米颗粒和MPH纳米颗粒处理的肺部的活体成像系统（IVIS）图像；（E）通过IVIS证实的肺中游离Cy5、Cy5标记的MP纳米颗粒和MPH纳米颗粒的定量分析

（6）MPH NPs在肺部感染中的抗菌效果

在验证MPH NPs的体外抗菌效果和体内肺部靶向性后，研究进一步评估了MPH NPs在肺部感染模型中的治疗效果。通过气管内注射S. aureus构建小鼠肺部感染模型（图6A），随后分别注射PBS、PMB、MIL-100NPs和MPH NPs。结果显示，MPH NPs治疗组小鼠的肺组织损伤显著减轻，炎症细胞浸润减少，细菌负荷明显降低，ROS生成增强（图6B-F）。这表明MPH NPs在体内肺部感染模型中也展现出有效的抗菌作用，促进了肺部损伤的修复。

图6. 对金黄色葡萄球菌肺部感染的治疗效果。（A）PBS、PMB、MIL-100纳米颗粒和MPH纳米颗粒用于肺部感染治疗的方案示意图；（B）各种治疗方法处理后的肺切片H&E染色的代表性图像；（C）通过DHE荧光探针评估接受各种治疗的小鼠肺中ROS的产生；（D）从受感染的肺组织中获得的细菌菌落的照片；（E）受感染肺组织中活细菌的定量分析；（F）使用BCA试剂盒测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白质含量