可见光驱动的生物能量和氧释放水凝胶在光照射下加速伤口愈合的示意图

（1）PTKM NPs的制备与表征

通过差速离心从菠菜中收获类囊体。经超离心、洗涤、超声处理得到TKM（2.45 mg/mL）。从透射电子显微镜（TEM）图像中可以看出，提取的TKM呈现出完整的层状结构（图1a）。PTA NPs显示出单分散的球形结构，直径为245 nm，表面粗糙（图1b）。TEM观察发现PTKM NPs具有明显的核壳结构（图1c和d）。PTKM NPs的zeta电位与原TKM相似（图1e），证实了PTA NPs被TKM包封。图1f为PTKM NPs的x射线光电子能谱。图1g为PTKM NPs的高分辨率O1s峰普图。在133.15 eV下检测到P2p表明存在TKM（图1h）。利用（BN-PAGE）分析了PTKM NPs的膜蛋白，证实了PTKM NPs上存在特定的光合活性相关膜蛋白，包括光合系统I （PS-I）、光合系统II （PS-II）和光收集复合物II (LHC-II)（图1i）。此外，PTKM NPs的紫外-可见（UV-Vis）光谱中出现了665 nm左右的吸附峰，而PTA NPs中没有（图1j），这是TKM叶绿素的典型吸收。总之，这些结果证明了利用PS-I/PS-II系统成功制备了用于光合作用的PTKM NPs。

用溶解氧仪在阳光和660 nm LED照射下评估其氧化能力。PTKM NPs在阳光照射下可以持续产氧，在130s后氧浓度达到0.69 mg/L以上（图1k）。LED照射12 min后，氧浓度超过1.0 mg/L（图11）。此外，PTKM NPs具有过氧化氢酶活性，可以在660 nm LED照射下催化过氧化氢（H₂O₂）产生氧气（O₂），如图1m所示，添加H₂O₂后的PTKM NPs溶液O₂含量明显升高，这在缓解糖尿病创面缺氧中起关键作用。使用WST-8法评估光照条件下PTKM NPs产生NADPH的能力（图1n）。当浓度为125 μg/mL时，PTKM NPs形成NADPH的倍数变化率为199.60%。相比之下，在黑暗条件下观察到NADPH的低效产生。这些结果证实，PTKM NPs保留了TKM的天然结构和光合性能，并作为能量供应商促进和调节细胞的生长（图1o）。此外，PTKM NPs具有继承自PTA NPs的优异的抗氧化能力。孵育90 min后，超过70%的DPPH自由基被PTA NPs消除（图1p）。综上所述，这些结果表明PTKM NPs可以作为一个具有光合氧/能量演化和自由基清除能力的一体化纳米平台，在光照下调节糖尿病伤口的代谢紊乱。

图3 PTKM NPs促进细胞代谢。（a）和（b）分别用NADPH和ATP测定试剂盒测定HUVECs细胞内NADPH和ATP水平。（c）660 nm LED照射下PTKM调节细胞代谢的机制示意图。（d）、(e)、(f)不同对照组差异代谢物火山图。（g）PTKM NPs与对照比较的差异代谢物相关网络图。（h）KEGG通路差异代谢物聚类热图。（i）和（j）三组L-亮氨酸和谷胱甘肽的差异代谢物小提琴图。（k）PTKM NPs与对照比较中差异代谢物调控网络示意图

（4）PTKM NPs调节炎症反应

为研究了PTKM NPs的抗炎能力，用脂多糖（LPS）诱导M1巨噬细胞活化，然后与TKM、PTA和PTKM NPs共培养4小时。通过显微镜染色评估巨噬细胞形态，如图4a所示，PTA和PTKM nps处理组巨噬细胞保持圆形和致密的形态，而lps诱导的巨噬细胞呈扁平状，有多个伪足。RAW264.7细胞面积的定量也证实了这一点（图4b）。进一步用免疫荧光染色CD86 （M1标记物）和CD206 （M2标记物）观察巨噬细胞的极化状态。如图4c和d所示，PTA和PTKM nps处理组的CD86+信号水平最低。而PTKM nps处理组CD206标记的M2巨噬细胞数量高于对照组（图4e）。定量数据显示，PTKM NPs组CD206标记的M2巨噬细胞百分比高于空白组（图4f）。这些结果表明，PTKM NPs可以抑制M1极化并诱导M2极化，而PTA NPs只能抑制M1极化。我们还注意到，PTKM NPs将促炎M1巨噬细胞重编程为抗炎M2巨噬细胞与LED暴露无关，流式细胞术数据进一步证实了荧光趋势（图4g）。PTKM NPs光合作用提供的O₂可以阻止巨噬细胞M1表型转换，阻止其过度表达缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)，从而促进巨噬细胞重编程为促再生的M2表型。由此可见，PTKM NPs通过抑制M1巨噬细胞极化、促进M2巨噬细胞活化发挥抗炎作用，有利于慢性糖尿病创面修复。

（5）PTKM-水凝胶的制备与表征

高倍扫描电镜图像显示，PTKM NPs分散在PTKM@HG水凝胶内部（图5a）。此外PTKM@HG水凝胶的CLSM 3D显微照片表明，PTKM NPs均匀分布在HG水凝胶中（图5b）。通过流变试验对含有3wt % PTKM NPs的PTKM@HG水凝胶的力学行为进行了评价。应变振幅扫描试验表明，在屈服应变为~ 200%时，G′和G″均出现急剧下降（图5c）。频率扫描显示PTKM@HG水凝胶具有粘弹性，其储存模量（G′）为1 kPa（图5d），低于人体皮肤组织的模量[75]。由于水凝胶中希夫碱共价键的动态性质，PTKM@HG水凝胶表现出优异的自愈能力。如图5e所示。为了进一步评估PTKM@HG水凝胶的自愈能力，进行了阶梯应变扫描。在5 rad/s的固定角频率下，连续剪切应变在500%和0.1%之间交替。当PTKM@HG水凝胶受到500%的高应变时，PTKM@HG水凝胶的G”大于G’而破裂（图5f）。随后，当PTKM@HG水凝胶以0.01%的低应变施加时，G”和G’值也能立即完全恢复到原始值，表明PTKM@HG水凝胶的自愈行为。PTKM@HG水凝胶展现出卓越的附着力，即使在经过拉伸和扭曲后，依然能牢固地粘附在猪皮上而不脱落（图5g）。同时，该水凝胶还具有出色的柔韧性，能够随着手指关节的弯曲而灵活变形（图5h）。将PTKM@HG水凝胶置于不同pH值（5.5、6.5、7.4、8.0）的缓冲液中，以探究PTKM NPs的释放行为。如图5i所示，在模拟酸性环境（pH 5.5和6.5）中，72小时内近90%的PTKM NPs从水凝胶中释放，这归因于酸性条件下席夫碱键的水解，使得PTKM NPs能从水凝胶中有效释放。此外，体外划痕实验表明，在LED照射下，PTKM@HG水凝胶显著加速了HaCaTs细胞的迁移（图5j）。经过48小时孵育，PTKM@HG + LED组的HaCaTs迁移率显著高于对照组及未照射LED的PTKM@HG组（图5k和图1）。同时，在高糖、低氧和高ROS条件下，PTKM@HG水凝胶上的HUVECs表现出增强的血管生成能力，管长和分支点增加，表明PTKM@HG水凝胶能有效促进血管生成（图5m）。这些结果表明PTKM@HG水凝胶具有良好的细胞相容性，可以在LED照射下有效释放PTKM NPs，促进细胞增殖、迁移和血管生成，这对于表皮和真皮的再生，加速伤口愈合至关重要。

图5 PTKM@HG水凝胶的表征。（a）PTKM@HG水凝胶的SEM图像。（b）CLSM图像显示fitc标记的PTKM NPs在水凝胶中的均匀分布。（c）和（d）PTKM@HG水凝胶的流变性能。（e）PTKM@HG水凝胶的宏观自愈能力。（f）PTKM@HG水凝胶应变测量。（g）PTKM@HG水凝胶在拉伸、弯曲、扭转作用下对猪皮的粘附能力。（h）显示水凝胶粘附于手指关节的照片。（i）水凝胶在不同缓冲液中PTKM NPs的释放曲线。（j）用LED照射PTKM@HG评估HaCaTs迁移的transwell系统示意图。（k）在没有或有LED照射的情况下，HG和PTKM@HG水凝胶处理在0和48小时时间间隔下HaCaTs迁移的代表性相衬图。（l）培养48小时后细胞覆盖面积的定量。（m）不同水凝胶处理6小时HUVECs血管形成的表示图像

（6）体内促进糖尿病慢性伤口愈合

使用体内荧光成像系统获得PTKM@HG水凝胶在伤口部位的荧光图像。在植入后24和72 h， PTKM NPs和HG水凝胶的荧光强度都很高（图6a）。此外，在表皮区和定殖皮肤表皮处观察到绿色荧光，表明PTKM NPs能够穿透角质层。图6c为糖尿病大鼠全层创面模型伤口愈合过程。伤口部位的LED照射时间（660 nm, 20 W）为每天30分钟（图6b）。伤口的代表性图像显示，未经任何处理的空白糖尿病伤口即使在21天后也难以完全愈合（图6d）。水凝胶（TKM@HG、PTA@HG、PTKM@HG）处理组创面愈合速度明显快于空白组。此外，LED照射有利于伤口愈合。与未LED照射组相比，所有LED照射组的创面尺寸均减小（图6e）。定量结果显示，PTKM@HG水凝胶+ LED治疗的愈合效果最好，第21天伤口愈合率为91.4%（图6f）。H&E结果显示，在PTKM@HG水凝胶+LED处理的伤口中，皮肤表皮和真皮相对完整，高度有序，炎症细胞浸润较少（图6g）。

图6 PTKM@HG水凝胶对糖尿病创面无或有LED照射修复的疗效观察。（a）PTKM@HG水凝胶在不同时间点的体内荧光成像。（b）LED照射下测试PTKM@HG水凝胶对糖尿病大鼠模型治疗效果的动物实验设计示意图。（c）PTKM@HG水凝胶治疗动物的示意图。（d）660 nm LED照射和不照射第21天不同处理组创面的代表性图像。（e）各治疗组小鼠伤口愈合的面积迹图。（f）愈合后21天创面大小变化。（g）不同处理组第21天伤口组织的代表性苏木精和伊红染色图像

（7）PTKM@HG水凝胶的体内抗氧化和免疫调节能力

在第3天，利用4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的免疫荧光染色来评估水凝胶对细胞成分（如脂质和DNA）的抗氧化保护作用。如图7a-d所示，PTKM@HG + LED组的4-HNE和8-OHdG水平在所有组中最低，这表明PTKM@HG水凝胶能有效减轻糖尿病创面愈合初期的氧化应激。进一步地，通过检查第3天伤口部位巨噬细胞的浸润和极化来探究水凝胶的抗炎效果。如图7e-f所示，CD86标记的免疫荧光染色显示，空白组和HG组中M1型巨噬细胞数量众多，暗示了强烈的炎症反应。相比之下，PTKM@HG水凝胶处理组中CD86阳性的M1型巨噬细胞表达减少，而CD206阳性的M2型巨噬细胞表达增加（图7g）。定量分析进一步证实，PTKM@HG水凝胶能显著降低炎症反应，并增强M2型巨噬细胞在创面部位的浸润和分布（图7h）。综合体外和体内实验结果，PTKM@HG水凝胶能有效降低M1型巨噬细胞的活化，促进M2型巨噬细胞的极化，有利于构建促进糖尿病创面愈合的再生微环境。

图7 PTKM@HG水凝胶在创面3天的体内免疫调节作用。（a）4-HNE和（c）8-OHdG在创面组织中的免疫荧光染色。（e）CD86和（g）CD206在创面组织中的免疫荧光染色。（i）创面组织HIF-1α免疫荧光染色。（b）、（d）、（f）、（h）、（j）创面组织切片4-HNE、8-OHdG、CD86、CD206、HIF-1α的荧光定量（f /F0）。（k）PTKM@HG水凝胶在糖尿病创面愈合早期调节创面微环境的示意图，包括（1）向创面微环境释放PTKM NPs；（2）供氧缓解缺氧；（3）减少炎症和氧化应激

(8)PTKM@HG水凝胶促进糖尿病创面新生血管和再上皮形成的供氧和供能能力

通过HIF-1α的免疫荧光染色，进一步评估了PTKM@HG水凝胶在伤口处的氧气供应能力。结果显示，在所有组别中，PTKM@HG + LED组的HIF-1α免疫荧光强度最低，证实了该水凝胶能在LED照射下释放氧气，从而缓解伤口局部的缺氧状况（图7i和j）。总体来看，PTKM@HG水凝胶显著降低了伤口的氧化应激，促进了巨噬细胞向M2型的极化，平衡了M1/M2的比例，并在伤口愈合的早期阶段缓解了局部缺氧，为伤口愈合创造了一个有利的微环境（图7k）。在第3天和第21天，通过PGC-1α的免疫荧光染色检测了伤口处的细胞代谢（图8a-d）。与空白组相比，PTKM@HG水凝胶联合LED处理显著增加了PGC-1α阳性细胞的数量，表明该水凝胶在创面愈合早期和后期都能够保护线粒体功能并增强细胞代谢。为了评估新生血管的形成，通过CD31和α-SMA的免疫荧光染色检测了内皮细胞和平滑肌细胞。结果显示，PTKM@HG水凝胶联合LED处理增强了伤口区域的新血管生成，为伤口修复提供了必需的氧气和营养（图8e-h）。在愈合后期，再上皮化是皮肤修复的关键环节。我们通过CK14和CK10的免疫荧光染色评估了表皮标志物的表达。在PTKM@HG水凝胶联合LED处理的组别中，伤口几乎完全闭合，被成熟的CK10阳性角质形成细胞覆盖，而空白组的细胞迁移速度明显较慢（图8i和j）。此外，CK14的染色还揭示了PTKM@HG水凝胶联合LED处理显著增加了表皮基底层毛囊的密度（图8k，l和m），表明该水凝胶能有效促进再上皮化，通过诱导角质形成细胞迁移和毛囊形成。